Mapas transcriptómicos espaciotemporales de embriones completos de ratón al inicio de la organogénesis

Nature Genetics volumen 55, páginas 1176–1185 (2023)Cite este artículo

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La orquestación espaciotemporal de la expresión genética es necesaria para un desarrollo embrionario adecuado. El uso de tecnologías unicelulares ha comenzado a proporcionar una mejor resolución de la dinámica regulatoria temprana, incluidas definiciones moleculares detalladas de la mayoría de los estados celulares durante la embriogénesis del ratón. Aquí utilizamos Slide-seq para construir mapas transcriptómicos espaciales de embriones embrionarios completos (E) 8.5 y E9.0, y parciales E9.5. Para respaldar su utilidad, desarrollamos sc3D, una herramienta para reconstruir y explorar "embriones virtuales" tridimensionales, que permite la investigación cuantitativa de patrones de expresión genética regionalizados. Nuestras mediciones a lo largo de los ejes embrionarios principales del tubo neural en desarrollo revelaron varios genes no anotados previamente con patrones espaciales distintos. También caracterizamos la identidad transcripcional conflictiva de los tubos neurales "ectópicos" que emergen en embriones mutantes Tbx6. En conjunto, presentamos un marco experimental y computacional para la investigación espaciotemporal de estructuras embrionarias completas y fenotipos mutantes.

El desarrollo embrionario requiere el momento y la ubicación precisos de numerosos procesos moleculares, celulares y tisulares1,2,3,4,5. Estos eventos se dirigen a través del control espaciotemporal de la expresión genética que organiza la especificación, migración y localización del tipo celular6,7,8,9. Cualquier alteración de esta regulación a menudo resulta en letalidad embrionaria o defectos de desarrollo5,10,11. Al final de la gastrulación y el inicio de la organogénesis (días embrionarios (E) 8,5-9,5), los tejidos experimentan cambios morfológicos importantes, como la formación de bucles cardíacos, la compartimentación cerebral y el plegamiento del tubo neural, para garantizar una estructura y función adecuadas12,13,14. A través de la neurulación, las células epiteliales de la placa neural se pliegan para formar un tubo morfológicamente definido, que exhibe una firma de expresión genética estratificada a lo largo de su eje dorsoventral (DV), que es necesaria para la posterior diversificación del subtipo neuronal15,16,17,18,19,20. ,21. Se han identificado muchos genes implicados en este proceso, pero aún se están investigando las redes reguladoras genéticas precisas que gobiernan estos patrones. Estudios unicelulares recientes han comenzado a proporcionar una comprensión más profunda de la topografía de la especificación del destino y resaltaron algunos mecanismos moleculares subyacentes a estas transiciones de estado celular22,23,24,25,26,27,28. Una limitación de los enfoques basados ​​en la disociación es su incapacidad para preservar la estructura del tejido, lo que impide el análisis de la expresión dentro del contexto nativo. Los avances recientes en tecnologías transcriptómicas espaciales han comenzado a llenar este vacío, con el objetivo de explorar la organización de los tipos de células dentro de los tejidos adultos y los embriones en desarrollo29,30,31,32,33,34,35,36,37,38.

En este estudio, utilizamos Slide-seq, una tecnología que genera datos de expresión génica en todo el transcriptoma con una resolución espacial de 10 µm33,39, para construir mapas de embriones completos durante la organogénesis temprana del ratón. Nuestros datos permitieron la exploración de patrones espaciales de expresión genética, distribuciones del estado celular, la reconstrucción de mapas transcriptómicos tridimensionales (3D) para el análisis de expresión genética "virtual" y la disección de fenotipos mutantes. Aprovechamos específicamente los datos para identificar la expresión genética regionalizada y las trayectorias de diferenciación en el espacio, centrándonos en la formación y los patrones del tubo neural. En general, proporcionamos un atlas espacial completo de alta resolución junto con un visualizador accesible y listo para usar para explorar patrones de expresión genética en el embrión de ratón en desarrollo.

Para mapear espacialmente las identidades celulares durante la organogénesis temprana, utilizamos Slide-seq en dos embriones representativos de E8.5, uno de E9.0 y tres de E9.5 parciales (Fig. 1a y Datos ampliados, Fig. 1a). Para los dos embriones E8.5, obtuvimos 15 y 17 secciones sagitales (10 µm de espesor), respectivamente, con intervalos de aproximadamente 30 µm entre ellas. Para el embrión E9.0, se obtuvieron 26 secciones sagitales con intervalos de 20 µm, y para los tres embriones E9.5, se obtuvieron 13 cortes de la línea media (Fig. 1a y Tabla complementaria 1). En total, recuperamos 533,116 cuentas de alta calidad con un valor medio de 1,798 transcripciones y 1,224 genes por cuenta (Datos ampliados, figuras 1b a d). Para determinar los estados de las celdas asignados a cada cuenta, asignamos cuentas computacionalmente a una referencia de una sola celda generada previamente (Datos extendidos, Fig. 1e, f) 26. Con esta información, extrajimos de cada cuenta secuenciada (1) coordenadas espaciales, (2) perfil de expresión génica asociada y (3) asignación del estado celular. En general, observamos una buena alineación de los estados celulares y la restricción espacial de genes marcadores, como Ttn (corazón), T (brote de la cola), Meox1 (somitas) y Sox2 (tubo neural, cerebro), entre otros (Datos ampliados, figura 2a). -mi). Además, observamos una alta reproducibilidad en la recuperación de una composición embrionaria y patrones de expresión genética comparables entre réplicas (Datos ampliados, figuras 2c a f).

a, Esquema del flujo de trabajo experimental y análisis de datos. Se obtuvieron secciones sagitales de embriones de ratón en E8.5, E9.0 y E9.5 para Slide-seq. Las líneas de puntos indican la posición aproximada de las secciones embrionarias. b, c, embriones en etapa E8.5 (b) y E9.0 (c) reconstruidos en 3D con seis estados celulares resaltados (cerebro, corazón, tubo neural, somitas, NMP, PSM); el gen marcador caudal Cdx2 y el gen marcador del tubo cardíaco Ttn se muestran (expresión genética normalizada) en un vISH del embrión E8.5 reconstruido1. Cada punto corresponde a una sola cuenta. El punto de vista se indica con el símbolo del ojo. Barras de escala, 100 µm. d, vista 3D de un embrión E8.5 que muestra los estados celulares indicados y las características anatómicas en campo claro (izquierda) o mapeados en el embrión E8.51 (derecha). Se muestran diferentes orientaciones. Barras de escala, 500 µm. e, Esquema de la estrategia utilizada para identificar la expresión genética localizada en tejidos. f, Mapa de calor de puntuaciones de localización para los 20 principales genes expresados ​​espacialmente diferencialmente en 3D para cada tejido analizado en el embrión E8.51 (consulte la Tabla complementaria 4 para ver la lista). Se resaltan los 20 genes principales (fila con puntuación z normalizada) en el cerebro. Una, anterior; LPM, mesodermo de la placa lateral; P, posteriores; D, dorsales; V, ventral; LPM, mesodermo de la placa lateral; NMP, progenitores neuromesodérmicos; PSM, mesodermo presomítico.

Para traducir nuestros datos bidimensionales a un embrión 3D, desarrollamos sc3D, un método computacional que permite la alineación de matrices transcriptómicas espaciales individuales para la reconstrucción 3D. Específicamente, utilizamos sc3D para alinear muestras seriales Slide-seq 'z' de embriones E8.5 y E9.0, lo que nos permitió capturar la distribución espacial y las morfologías de los tejidos emergentes al inicio de la organogénesis (Datos ampliados, Fig. 3a). , b y figuras complementarias 1 y 2). Esto, a su vez, permitió mediciones cuantitativas de sus volúmenes (250–39,264 × 103 µm3), que fueron reproducibles en embriones replicados individuales (Datos ampliados, figura 3c-e, figura complementaria 1, película complementaria 1 y tabla complementaria 2). Además, demostramos que la reconstrucción se mantuvo consistente a medida que aumentaba el intervalo entre cortes, con una distorsión mínima en los ejes de rotación (Datos ampliados, figura 3f). Es importante destacar que sc3D también permite la reconstrucción 3D de otros conjuntos de datos transcriptómicos espaciales con alta precisión, velocidad y robustez para una resolución espacial reducida40 (Datos ampliados, figuras 4a a c y tabla complementaria 3).

Luego utilizamos los embriones reconstruidos para realizar una hibridación in situ "virtual" (vISH) de más de 27.000 genes en una escala cuantitativa, con la oportunidad de consultar la expresión genética del gradiente a lo largo de cualquier eje del cuerpo, plano de inclinación y ángulo de rotación (Fig. 1b). d, Figuras complementarias 1 y 2, y Películas complementarias 1 a 4). Para aumentar aún más la accesibilidad a sc3D, desarrollamos sc3D-viewer, un entorno interactivo y fácil de usar para explorar la representación de proyección y aproximación de colector uniforme (UMAP), mapas espaciales del estado celular y vISH para combinaciones de genes simples y duales (métodos en Información complementaria ). Para investigar la expresión espacial de genes dentro de cada tipo de tejido, calculamos las correlaciones de todo el genoma entre los volúmenes de tejido y las densidades de las células que se expresan para generar una puntuación de localización que nos permitió clasificar los genes dentro de cada tejido en función de su restricción espacial en la expresión. Este análisis identificó un conjunto de genes regionalizados, específicos de tejido y altamente informativos dentro del embrión y en todas las réplicas, así como en las etapas de desarrollo (Figs. 1e, f y 2a, Datos ampliados, Fig. 4d-g y Tabla complementaria 4). Por ejemplo, encontramos puntuaciones altas de localización para genes como Nppa, Tdgf1, Cck y Sfrp5 en el tubo cardíaco en desarrollo (Datos ampliados, figuras 5a a d y película complementaria 5). El mapeo de estos genes en nuestro embrión digital reveló que sus dominios de expresión marcan ejes de desarrollo específicos (anterior-posterior (AP), DV y derecha-izquierda) y delinean presuntas estructuras anatómicas, como los ventrículos y aurículas primitivos, el tracto de salida, el cardiomiocito. gelatina y el polo venoso, respectivamente41,42,43, a diferencia de la expresión genética espacialmente ubicua que se observa en la sangre (Datos ampliados, figuras 5c-e). Además, la expresión de Cck y Sfrp5 distingue espacialmente los dominios de cardiomiocitos diferenciados de los indiferenciados (Datos ampliados, figura 5d) 41,42,43. En conjunto, esto demuestra nuestra capacidad para identificar marcadores regionalizados y estudiar la organización de dominios distintos dentro de tejidos complejos en desarrollo a lo largo de los ejes de desarrollo.

a, Gráfico espacial esquemático (izquierda) y de expresión genética normalizada (derecha) de genes seleccionados (resaltados en la Fig. 1f) en el cerebro 3D del embrión E8.51, E9.0 y E9.5 (matriz E9.5_3). Cada punto representa una sola cuenta. b, Gráfico espacial de la velocidad del ARN en la región del cerebro E9.5 (matriz E9.5_3). La dirección del vector indica la trayectoria y la longitud denota la magnitud. Las regiones de baja velocidad se indican como R1, R2, R3 y R4. R1, prosencéfalo de la cresta neural; R2, límite telencéfalo-diencéfalo; R3, límite diencéfalo-mesencéfalo; R4: límite mesencéfalo-rombencéfalo; y R5, límite entre el rombencéfalo y la médula espinal. c, Gráfico espacial que muestra los límites del cerebro (arriba) y los genes expresados ​​espacialmente diferencialmente enriquecidos en la parte superior a lo largo de los límites del cerebro R2, R3 y R4 (representados como expresión normalizada con puntuación z de fila) en E9.5 (matriz E9.5_3). La lista completa de genes se puede encontrar en la Tabla complementaria 5. Barra de escala para todas las gráficas, 50 µm. C, caudales; D, dorsales; R, rostral; V, ventral.

Entre E8.5 y E9.5, la porción más anterior del tubo neural se desarrolla en tres vesículas distintas (prosencéfalo-prosencéfalo, mesencéfalo-mesencéfalo y rombencéfalo-rombencéfalo), que juntas forman el cerebro primordial20,21,44,45,46 ,47. Nuestro mapa transcriptómico espacial de alta resolución del prosencéfalo-prosencéfalo en embriones E9.5 nos permitió identificar regiones presuntas de telencéfalo y diencéfalo y delinear el patrón DV del diencéfalo-mesencéfalo (Datos ampliados, figuras 6a-e)48. Para estudiar la aparición de tales patrones, analizamos el transcriptoma de los cerebros E8.5, E9.0 y E9.5 y descubrimos que genes como Foxg1, Barhl2, Otx2, En1 y Egr2 muestran patrones de expresión regionalizados ya en E8.5 ( Figuras 1f y 2a). Mientras que Foxg1 estaba confinado al prosencéfalo rostral, definiendo el presunto telencéfalo, Barhl2 se expresaba caudalmente, marcando ya el presunto diencéfalo49,50,51. Rax, un marcador del ojo en desarrollo, exhibió un confinamiento espacial de la expresión génica entre E8.5 y E9.5, definiendo la futura copa óptica (Fig. 2a). Por tanto, parece que la restricción espacial de la expresión genética precede a la segregación anatómica. Para explorar más a fondo la relación entre el compromiso del destino celular y la restricción espacial de las estructuras emergentes, utilizamos la velocidad espacial del ARN sin supervisión y sin conocimiento previo de los estados celulares52. Recuperamos distintos rangos de dinámica de velocidad con trayectorias convergentes o divergentes, potencialmente correspondientes a transiciones escalonadas o estados estacionarios celulares (Fig. 2b y Datos extendidos Fig. 7a, b). Una inspección más cercana de las regiones de baja velocidad (definidas por la longitud de baja velocidad y la confianza de la direccionalidad del vector), combinada con la expresión de genes marcadores conocidos, reveló la presencia de dominios de campo progenitores (cresta neural anterior R1), así como de neuronas diferenciadas. territorios (límite R5 entre el rombencéfalo y la médula espinal) (Datos ampliados, figuras 6b, cy 7c). Además, las áreas con trayectorias divergentes resaltaron regiones límite, como el límite mesencéfalo-rombencéfalo R4, que estaba marcado por los patrones de expresión restrictivos y exclusivos de Otx2 en el mesencéfalo y Gbx2 en el rombencéfalo, así como Fgf8 en el límite (Datos extendidos Figura 7c)53.

Aunque los extremos de los vectores no representan necesariamente un estado terminalmente diferenciado, tal relación podría inferirse cuando se sabe que las trayectorias espaciales coinciden con los procesos de patrones de desarrollo. Por ejemplo, las trayectorias observadas en R4 se asemejan a la especificación del linaje de los progenitores del rombencéfalo medio que generarán células neuronales que posteriormente poblarán todo el mesencéfalo y las áreas anteriores del rombencéfalo21. Además, nuestro mapa de alta resolución permitió una vista más granular de los determinantes moleculares de los límites en desarrollo antes de la formación de la constricción anatómica (Fig. 2c y Tabla complementaria 5). Analizamos los tres límites que delimitan las principales regiones del cerebro para identificar características que podrían arrojar luz sobre los mecanismos reguladores implicados en la regionalización del cerebro. En R2 y R4, identificamos varias moléculas de señalización (WNT, FGF) y efectores posteriores que ratifican el papel de estos límites como centros de señalización que instruyen el patrón de las estructuras adyacentes (la zona limitante intratalámica (ZLI) y el organizador ístmico). Si bien la interacción entre la señalización WNT y FGF en el límite del mesencéfalo (R4) es bien conocida, su papel en el límite telencéfalo-diencéfalo (R2), donde la señalización SHH tiene un papel importante54, ha sido menos estudiado. En este estudio, mostramos la restricción espacial de la expresión de Wnt7b hasta el límite junto con Wnt8b (Datos ampliados, figura 7d). Aunque Wnt7b se expresa en las partes rostral y dorsal del diencéfalo55, aún no se ha descrito su coexpresión y colocalización con Wnt8b, que se sabe que se expresa dentro del ZLI56. En comparación con las otras regiones analizadas, el límite entre el diencéfalo y el mesencéfalo (R3) se caracteriza por una baja actividad de la molécula de señalización, una alta expresión de marcadores neuronales (proteínas de neurofilamentos y genes neuronales) y una firma de velocidad de ARN convergente, lo que sugiere la presencia de una región neuronal más madura en lugar de otra. un dominio progenitor (Fig. 2c y Tabla complementaria 5). Por lo tanto, nuestro análisis puede ayudar a identificar moléculas relevantes como CDH8 (Fig. 2c y Tabla complementaria 5), ​​que se sabe que compartimenta el límite entre el diencéfalo y el mesencéfalo junto con otras cadherinas57. Además, dentro de la región del prosencéfalo, mapeamos distribuciones de expresión genética conocidas y no caracterizadas, incluidas aquellas involucradas en el desarrollo ocular (Datos ampliados, Fig. 7e, f). Al examinar tales patrones durante el desarrollo temprano del cerebro, estratificamos la aparición espacial de estructuras anatómicas.

Mientras que el tubo neural anterior se desarrolla hasta convertirse en el cerebro, la porción posterior genera la futura médula espinal durante el alargamiento del tronco. El tronco embrionario consta de estructuras morfológicamente diversas con distintos orígenes de desarrollo que aseguran una correcta elongación axial y segmentación del plan corporal (Fig. 3a)58,59,60. A medida que el embrión se desarrolla, las células progenitoras axiales adquieren un potencial de diferenciación bipotente que permite la generación de derivados neuroectodérmicos y mesodérmicos58,59,60. En concreto, estas células, conocidas como progenitores neuromesodérmicos (NMP), generan la porción posterior del tubo neural y el mesodermo paraxial a través del frente de determinación (mesodermo presomítico (PSM) y somítico) (Fig. 3a)58,59,60 . Para perfilar la regionalización de la expresión génica en el tronco en desarrollo en 3D, primero mapeamos los estados celulares correspondientes a las NMP, PSM y somitas (trayectoria de somitogénesis) en nuestro embrión virtual E8.5 (Fig. 3b). El vISH de Tbx6, Ripply2 y Meox1 confirmó aún más los patrones de expresión génica organizados a lo largo del AP y la simetría derecha-izquierda involucrada en la somitogénesis (Fig. 3b). A continuación, para comprender cómo una firma de expresión genética regionalizada afecta la dinámica del desarrollo, perfilamos las trayectorias de desarrollo del tronco combinando mediciones transcripcionales de pseudotiempo con información espacial. UMAP y la visualización espacial revelaron un continuo de estados transcriptómicos a lo largo de las trayectorias somíticas y neurales (Fig. 3c, d y Datos extendidos Fig. 8a-c). Luego investigamos esta relación con más detalle y calculamos las distancias transcripcionales y espaciales de cada cuenta a cada otra cuenta dentro de cada tejido del tronco en un embrión E9.5 (distancias 'pseudotemporales' y 'espaciales', respectivamente) (Fig. 3e)61 ,62,63. Curiosamente, descubrimos que los cambios en los transcriptomas no son necesariamente proporcionales a las distancias entre células y que su relación es específica de cada tejido. En particular, las células progenitoras (NMP y PSM) ocupan una pequeña región del embrión, mostrando distribuciones de distancia espacial baja concurrentes con una baja variabilidad transcripcional (Fig. 3e). Por otro lado, las células más diferenciadas (tubo neural y somitas) se distribuyen ampliamente a lo largo de la región del tronco (distribución a gran distancia), incluso en casos de bajas diferencias transcripcionales (Fig. 3e). También observamos un grupo de células proximales en el tubo neural caracterizado por una notable variabilidad transcripcional que, cuando se asignan a matrices espaciales, representan patrones DV locales (Fig. 3e línea de puntos y Fig. 3f). En conjunto, nuestros hallazgos muestran que durante el desarrollo del tronco, los progenitores se diferencian en estados celulares posteriores en un dominio espacial restringido antes de la dispersión.

a, Esquema de la organización espacial de los estados celulares en la región del tronco embrionario en E8.5 y vista detallada del proceso de somitogénesis. b, Gráfico espacial esquemático y 3D de E8.5 (embrión2), que muestra estados celulares seleccionados y vISH de Tbx6, Ripply2 y Meox1 en la región del tronco. Cada punto indica una cuenta y el color corresponde al estado indicado. Barra de escala, 200 µm. c, UMAP que muestra cuentas de embriones E8.5 y E9.5 correspondientes a los estados NMP, PSM, somitas y tubo neural (izquierda) y la distribución espacial correspondiente (derecha) en un embrión E9.5 (matriz E9.5_2). Cada punto indica una cuenta y el color corresponde al estado indicado. Barra de escala, 100 µm. d, UMAP que muestra un análisis de pseudotiempo a lo largo de las trayectorias de diferenciación somítica y neural (izquierda) y la distribución espacial correspondiente (derecha) en un embrión E9.5 (matriz E9.5_2). Cada punto indica una cuenta y el color corresponde al valor de pseudotiempo asignado. Barra de escala, 100 µm. e, Gráfico de densidad que muestra la diferencia de pseudotiempo calculada (eje y) versus la distancia espacial medida (eje x) entre todas las cuentas del mismo estado de celda. Cada punto es una comparación por pares. La línea de puntos delimita células con baja distancia espacial y gran divergencia transcripcional en el tubo neural. f, Gráfico espacial que muestra las cuentas (arriba) dentro de la línea de puntos (Fig. 2e) y la distribución de valores de pseudotiempo en un tronco embrionario E9.5 (matriz E9.5_3) que refleja el patrón del tubo neural. Cada punto representa una cuenta. Barras de escala, 100 µm.

A medida que el tronco se desarrolla y los tejidos se extienden en el espacio, las diferencias transcripcionales a lo largo de su longitud determinan la identidad posicional de varios estados celulares. Por ejemplo, entre E8.5 y E10.5, el tubo neural se pliega desde la placa neural y sufre un patrón para establecer la estratificación celular para la futura médula espinal16,17,19,20,21,62,63,64. Los programas regionalizados de expresión génica garantizan una mayor diversificación de los tipos neuronales a lo largo de los ejes AP y DV16,17,19,20,21,62,63,64. Para comprender los programas genéticos involucrados en el establecimiento de dominios progenitores discretos a lo largo del tubo neural, aislamos las cuentas correspondientes y buscamos patrones de coexpresión espacial a lo largo de los ejes AP (aproximadamente 4600 µm) y DV (aproximadamente 320 µm) ('axis profiling'). ') (Fig. 4a y Datos ampliados Fig. 8d). Identificamos distintos patrones de expresión a lo largo del eje AP del tubo neural para genes involucrados en varias funciones celulares y moleculares (Datos ampliados, figura 8e). Como se esperaba, los genes Hox se encontraban entre los genes más localizados dentro de este eje (Fig. 4b)65,66. Los factores HOX interactúan entre sí para regular los programas transcripcionales. Para identificar supuestos grupos funcionalmente colineales, realizamos un análisis del módulo del gen Hox combinado con resolución espacial y encontramos seis módulos distintos de expresión del gen Hox, desde el módulo más anterior (módulo Hox I, que comprende Hoxb2 y Hoxa3) hasta el más posterior (módulo Hox). VI, que contiene Hoxd8 y Hoxa9 (Fig. 4c y Datos ampliados Fig. 8f, g). A continuación, examinamos el eje DV del tubo neural y pudimos resolver y anotar estructuras bien estudiadas como la notocorda, la placa del piso, el tubo neural real y la placa del techo en función de su firma transcripcional espacialmente restringida (Fig. 4a, d y Datos ampliados Fig. 9a, b) 29. Entre los genes más restringidos espacialmente, encontramos marcadores que definen el linaje bien conocidos como Zic1 , Pax3, Olig2, Nkx6-1 y Nkx2-9, que confirmamos mediante hibridación in situ de ARN-fluorescencia (FISH) (Fig. 4d – f y Datos ampliados Fig. 9c – e). También identificamos 43 genes adicionales en el tubo neural temprano del ratón en la etapa E9.5 que parece exhibir un patrón de expresión a lo largo del eje DV en la zona ventricular que contiene progenitores (Fig. 4d – f, datos ampliados, figura 9f y tabla complementaria 7). Nuestros resultados muestran la utilidad de la herramienta de perfilado de ejes para detectar patrones de expresión génica bien estudiados a lo largo del eje del tubo neural y su aplicación en el descubrimiento de novo de genes con expresión localmente restringida.

a, Esquema de un embrión en etapa E9.5, con cuentas correspondientes al tubo neural (verde) y los ejes indicados a lo largo de los cuales se realizó el perfilado (matriz E9.5_10). b, Mapa de calor que muestra los 160 genes principales con patrones de expresión (fila con puntuación z normalizada, filtrada para un cambio logarítmico superior a 0,05 y una tasa de descubrimiento falso (FDR) <0,01; consulte la Tabla complementaria 7 para ver la lista de genes) en los 25 contenedores espaciales generados a lo largo del eje AP. La expresión de los genes Hox está resaltada (derecha). Barra de escala, 184 µm. c, Gráficos espaciales que muestran la expresión normalizada (puntuación z bin) de los módulos Hox (I, II, III, IV, V, VI) en el tubo neural E9.5 (matriz E9.5_10). Se indican dos genes representativos para cada módulo. Barra de escala, 100 µm. d, Mapa de calor que muestra los 160 genes principales con patrones de expresión (fila con puntuación z normalizada, filtrado para un cambio logarítmico superior a 0,05 y FDR <0,01; consulte la Tabla complementaria 7 para ver la lista de genes) en los ocho contenedores espaciales generados a lo largo el eje DV. Se resalta la expresión de genes con patrones conocidos y nuestros identificados. Barra de escala, 40 µm. e, RNA-FISH que muestra la validación de patrones conocidos (arriba) y nuestros identificados (abajo) a lo largo del eje DV del tubo neural. En las imágenes se muestra un único corte de tejido obtenido de la porción posterior del tubo neural. n = 3 embriones con patrón de tinción reproducible para cada objetivo perfilado de embriones WT. Barras de escala, 50 µm. f, Esquema que muestra los patrones espaciales de genes conocidos (dentro del tubo) y nuestros identificados (fuera del tubo) a lo largo del eje DV del tubo neural en etapa E9.5.

Después de catalogar el transcriptoma espacial subyacente a los ejes del tubo neural en desarrollo, investigamos un fenotipo mutante embrionario clásico donde surgen tubos neurales ectópicos. El factor de transcripción T-box TBX6 se expresa en el PSM y es necesario para la segmentación y especificación de los somitas10. En embriones que carecen de Tbx6, los tubos neurales ectópicos surgen a expensas de los compartimentos somíticos (Fig. 5a)11,67. Para evaluar la identidad molecular precisa de los tubos neurales ectópicos, utilizamos la alteración de Tbx6 basada en CAS9 en cigotos y realizamos Slide-seq en secciones transversales de embriones E9.5 de tipo salvaje (WT) y mutante Tbx6 (Tbx6 knockout (KO)). , centrándose en el segmento posterior de la región del tronco donde surgen múltiples tubos en ausencia de Tbx6 (Fig. 5a y Datos ampliados Fig. 10a-c)26,68,69,70. Como era de esperar, observamos una representación excesiva de cuentas asignadas al grupo del tubo neural en embriones Tbx6 KO en comparación con los controles WT, junto con una falta proporcional de células somíticas (Fig. 5a).

a, Sección transversal de embriones teñidos con DAPI (arriba) y gráfico espacial (abajo) que muestra las morfologías de tejido anotadas (somitas, tubo neural) y los estados celulares correspondientes en embriones E9.5 WT y KO. El experimento KO se realizó de forma independiente cinco veces en total con n > 5 embriones por experimento y arrojó consistentemente el mismo fenotipo. El experimento Slide-seq se realizó en una sección transversal representativa para embriones WT y dos para embriones KO. b, Mapa de cuadrícula espacial que muestra la organización del tubo neural 1, 2 y las células somíticas en embriones WT y Tbx6 KO. c, UMAP que muestra la proyección de las celdas asignadas a los grupos indicados en la trayectoria del tronco (Fig. 3c), y el tamaño de los puntos representa el grado de incertidumbre del mapeo en la posición respectiva. d, Gráfico de puntos que muestra la expresión de los genes indicados en los tres grupos (el tamaño de los puntos es el porcentaje de células por grupo; el color es la expresión normalizada promedio del grupo). e, ARN-FISH de los genes indicados en una sección transversal de embriones E9.5 WT y KO. Las líneas de puntos en el esquema indican la posición AP dentro del tronco del cual se obtuvieron las secciones. Se muestra una sección representativa de embriones WT y KO en E9.5. El patrón de expresión se verificó en dos de los experimentos KO con n > 3 embriones por experimento. Barras de escala, 50 µm. f, Esquema que muestra la identidad transcripcional y el patrón característico de los tubos neurales ectópicos que surgen en ausencia de expresión de Tbx6, destacando su identidad transcripcional conflictiva.

A continuación, reagrupamos las perlas que tenían una identidad neural y somítica para inspeccionar más de cerca las diferencias entre los tubos neurales de los embriones Tbx6 KO. Descubrimos que las células del tubo neural se resuelven posteriormente en cuatro subgrupos transcripcionales, que denominamos cresta neural, placa neural y dos grupos principales de tubos neurales (tubos neurales 1 y 2, datos ampliados, figura 10d)71,72,73,74. 75. Curiosamente, cuando asignamos espacialmente las dos células del grupo del tubo neural en las matrices WT y Tbx6 KO, descubrimos que las células del tubo neural 1 se asignaron al tubo central en ambos genotipos. Por el contrario, las células del tubo neural 2 se asignaron a ambos lados del tubo central exclusivamente en Tbx6 KO, lo que sugiere que los tubos ectópicos se caracterizan por un estado transcripcional distinto (Fig. 5b). Específicamente, las células de los tubos ectópicos muestran una identidad transcripcional que se encuentra entre las células somíticas y neuronales, a pesar de su identidad neuronal predicha (Fig. 5c y Datos ampliados Fig. 10e, f). Observamos altos niveles de genes mesodérmicos específicos, incluidos Aldh1a2 y Mest (Fig. 5d, e). Concomitantemente con la expresión de marcadores mesodérmicos, las células asignadas al tubo ectópico tenían una expresión reducida o ausente de genes marcadores de patrones del tubo neural clásicos como Olig2, Gm38103, Sox3, Nkx6-1 y Shh (Fig. 5d, e). No obstante, la firma mesodérmica se superpuso con la expresión conflictiva de otros genes característicos del patrón del tubo neural, como Foxa2 y Pax6 (Datos ampliados, figura 10g)11.

En resumen, nuestro análisis transcriptómico espacial de los tubos ectópicos en embriones mutantes Tbx6 identificó células que adquieren una identidad transcriptómica mixta, caracterizada por la expresión de genes mesodérmicos y un patrón de expresión parcial del gen DV (Fig. 5f).

Realizamos perfiles transcriptómicos espaciales de todo el embrión utilizando Slide-seq para descifrar los patrones de expresión genética estrechamente regulados de aproximadamente 27.000 genes en embriones en desarrollo al inicio de la organogénesis. La reconstrucción de embriones digitales en 3D utilizando sc3D permitió la exploración cuantitativa de patrones y gradientes de expresión genética de forma virtual in situ. Combinado con el desarrollo de sc3D-viewer (un complemento de Napari)76, una plataforma de visualización accesible, interactiva y fácil de usar para registrar y explorar datos genómicos espaciales en 3D, facilitamos la exploración rápida y fluida de la distribución de tipos celulares y los patrones de expresión génica a lo largo de cualquier eje de desarrollo determinado, incluida la posibilidad de reconstruir tejidos a partir de otros conjuntos de datos transcriptómicos espaciales.

Los métodos de secuenciación unicelular con resolución espacial continúan evolucionando rápidamente37,38,40,77,78,79. El aumento de los conjuntos de datos disponibles requerirá enfoques computacionales más rápidos y precisos para aprovechar al máximo la información espacial agregada. sc3D contribuye al análisis en profundidad de la topología y geometría de la expresión genética y los patrones de coexpresión, proporcionando la infraestructura para comenzar a modelar la difusión de la expresión genética y su interacción en tejidos embrionarios. La estructura de datos sc3D ha sido diseñada deliberadamente para ser similar a la de las salidas del algoritmo de seguimiento celular basado en imágenes. Esta similitud facilitará la transferencia de algoritmos de alineación entre muestras basados ​​en el seguimiento celular, como Tardis, al campo transcriptómico espacial31.

Ha sido un desafío explorar la dinámica en la que evolucionan los transcriptomas a medida que los progenitores se diferencian en su distribución espacial. El análisis de las trayectorias de diferenciación en el cerebro embrionario y las regiones del tronco reveló varios dominios discretos en los que los cambios transcripcionales convergen o divergen espacialmente, lo que indica una relación no lineal y específica de tejido. Observamos que las relaciones espacialmente dependientes se asociaban frecuentemente con regiones caracterizadas por altos gradientes de señalización intercelular. Estos cambios pueden reflejar la especificación de sublinajes, la migración del grupo de progenitores, la maduración de subtipos diferenciados o la regionalización de destinos específicos. Estudios adicionales que combinan el registro de linaje, la información espacial y el perfil transcriptómico unicelular podrían ayudar a resolver la relación causal entre los programas de expresión génica, la asignación espacial y la especificación del destino celular.

El recableado transcripcional a lo largo de los ejes AP y DV del tubo neural en desarrollo define dominios de expresión génica discretos que son fundamentales para controlar la futura diversificación celular16,17,19,20,21,62,63,64. Descubrimos varios genes interesantes que muestran patrones de expresión genética regionalizados a lo largo de estos ejes, incluidos reguladores epigenéticos y metabólicos que requieren más investigación para determinar su papel molecular y sus implicaciones funcionales.

Como ejemplo de aprovechamiento de la información espacial en un experimento de perturbación, proporcionamos una caracterización transcriptómica detallada de la identidad molecular de los tubos neurales ectópicos que surgen en embriones mutantes Tbx6. Inesperadamente, lo que históricamente se ha asignado como tubos neurales adicionales son estructuras morfológicamente tubulares con patrones incompletos y expresión continua de genes mesodérmicos que generalmente se asocian con identidades de células mesenquimales y no epiteliales. Esto sugiere un desacoplamiento de los programas transcripcionales y los resultados morfogenéticos durante el desarrollo embrionario, en el que los gradientes de señalización, la matriz extracelular y las pistas mecánicas probablemente desempeñan papeles cruciales80. Si bien los embriones mutantes Tbx6 exhiben un fenotipo distinto y bien caracterizado, muchos otros genes pueden causar cambios morfológicos menos obvios y, por lo tanto, se beneficiarán de una caracterización espaciotemporal similar para definir sus funciones de desarrollo.

Nuestro recurso accesible de mapas transcriptómicos espaciales al inicio de la organogénesis y herramientas computacionales de apoyo ayudarán a la exploración continua del desarrollo de los mamíferos. Además, el marco presentado en este estudio podría implementarse para realizar fenotipado espacial molecular en muchas perturbaciones adicionales. Por último, al combinar el mapeo de linajes y el análisis multiómico, a partir de este trabajo se podría desarrollar un mapa completo de la red reguladora de genes durante la embriogénesis.

Todos los experimentos descritos en este artículo cumplen con las normas éticas pertinentes de las respectivas instituciones. Todos los experimentos fueron aprobados por el Landesamt für Gesundheit und Soziales. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones de bienestar animal aprobadas por el Instituto Max Planck de Genética Molecular (G0243/18-SGr1_G y ZH120).

Se diseccionaron embriones WT E8.5, E9.0 y E9.5 de los úteros de ratones CD-1 apareados naturalmente en 1 × HBSS (n.º de catálogo 14175053, Gibco) en hielo. Los embriones se clasificaron según la morfología, el tamaño y el número de somitas (etapa de 3 a 5 pares de somitas para E8.5, etapa de 10 a 12 pares de somitas para E9.0 y etapa de 15 a 18 pares de somitas para E9.5). Se extrajeron tejidos extraembrionarios de los embriones E9.5 antes del procesamiento. Los embriones se lavaron en HBSS 1x frío con 2 U ml-1 de inhibidor de RNasa (n.º de catálogo N8080119, Thermo Fisher Scientific) y se incluyeron en solución OCT (n.º de catálogo 23-730-571 y 23-730-572, Thermo Fisher Scientific). ). Los embriones en OCT se orientaron bajo un estereoscopio, se colocaron inmediatamente en hielo seco para su congelación instantánea y finalmente se almacenaron a -80 °C. Los embriones mutantes Tbx6 se generaron mediante un protocolo previamente establecido26,68,69,70. Brevemente, los cigotos fertilizados in vitro (FIV) se electroporaron con el complejo Alt-R CRISPR-Cas9 RNP con guías dirigidas a tres exones diferentes de Tbx6 (Tabla complementaria 10). Los embriones que se desarrollaron hasta la etapa de blastocisto se retransfirieron a animales sustitutos pseudopreñados CD-1 como se describe. Todos los embriones mutantes Tbx6 aislados en E9.5 mostraron el fenotipo mutante (brote de cola agrandado, tubos neurales ectópicos). La región del tronco se diseccionó a partir de embriones WT y mutantes (partes extraídas por encima de la yema de la extremidad y el corazón), se incorporó en solución OCT y se congeló a -80 °C.

Los animales se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en jaulas ventiladas individualmente a 22 ± 2 °C, 55 ± 10% de humedad con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (6:00–18:00). La FIV se realizó con donantes de ovocitos B6D2F1 (de 7 a 9 semanas de edad; Envigo) y se aisló esperma de machos B6.CAST F1 (de 2 meses de edad, generados internamente mediante la reproducción de hembras C57BL/6J y machos CAST/EiJ). Para los experimentos de transferencia de embriones, se cruzaron ratones hembra CD-1 pseudopreñadas (Hsd:ICR; 9 a 12 semanas de edad; 21 a 25 g; Envigo) con machos vasectomizados (Swiss Webster; mayores de 13 semanas; Envigo).

Se equilibraron bloques de OCT recién congelados con embriones de ratón a -20 °C en un criostato (CM1950, Leica Biosystems), se montaron en un bloque de corte con OCT, se cortaron con un espesor de 10 μm y luego se superpusieron y fundieron en matrices espaciales secuenciadas33. 39. Se recogieron secciones sagitales de embriones completos a los siguientes intervalos: embriones E8,5, distancia de 30 μm; Embriones E9.0, distancia de 20 μm; y para E9.5, se recolectaron secciones de la mitad del volumen de tres embriones independientes. Uno para la región de la cabeza y otro para la región torácica y del tronco de cada embrión (Fig. 1a y Tabla complementaria 1). Se recolectó una sección transversal E9.5 de la región del tronco (tronco posterior correspondiente a la región del tubo neural somita) para embriones mutantes WT y Tbx6 con un espesor de sección de 10 µm.

El ARN-FISH de embrión completo se realizó de acuerdo con el protocolo de Molecular Instruments con algunas modificaciones. Brevemente, los embriones fijados durante la noche con paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C se lavaron tres veces durante 10 minutos cada uno con 1x PBS con Tween 20 al 0,1% (PBST) a 4 °C. Los embriones se deshidrataron en una serie de concentraciones crecientes de metanol + lavados de PBST, durante 10 minutos en cada lavado a 4 °C (25% metanol; 50% metanol; 75% metanol; 100% metanol). Los embriones se almacenaron a -20 °C durante la noche o más. A continuación, los embriones se rehidrataron en una serie de concentraciones decrecientes de metanol + lavados de PBST, durante 10 minutos en cada lavado a 4 °C (100% metanol; 75% metanol; 50% metanol; 25% metanol; 100% PBST). Después de dos lavados durante 10 minutos a 4 °C en PBST, los embriones se blanquearon con peróxido de hidrógeno al 6% (para la actividad de la peroxidasa endógena en las células sanguíneas) a 4 °C durante 20 minutos. Después de dos lavados en PBST durante 10 minutos cada uno a 4 °C, los embriones se trataron con 10 µg ml-1 de proteinasa K (n.º de catálogo EO0491, Thermo Fisher Scientific) durante el tiempo indicado a temperatura ambiente (E9.5: 10 min). . Después de dos lavados con PBST durante 15 minutos cada uno, los embriones se fijaron posteriormente en PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces en PBST durante 15 minutos en cada paso. Luego se prepararon los embriones para la hibridación incubándolos en tampón de hibridación a 37 °C durante 1 h. Las sondas se resuspendieron en tampón de hibridación a una concentración de 1 pM y se incubaron con embriones durante la noche a 37 °C. Los embriones se lavaron cuatro veces con tampón de lavado de sonda durante 15 minutos cada lavado a 37 °C, seguido de tres lavados en tampón de hibridación SSCT 5x + Tween 20 al 0,1%. Se prepararon horquillas fluorescentes como lo describe el fabricante a una concentración de 0,06 µM. cada horquilla en el tampón de amplificación. Luego, los embriones se incubaron en tampón de amplificación antes de la incubación con sondas de horquilla durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. El exceso de sondas se eliminó mediante cinco lavados de 15 minutos cada paso en SSCT 5X a temperatura ambiente en la oscuridad. Los núcleos se contratiñeron mediante incubación con 2 µg ml-1 de 4,6-diamidino-2-fenilindol. Los tampones y las secuencias de sonda utilizadas en este estudio están disponibles en Molecular Instruments y su ID única se puede encontrar en la Tabla complementaria 10. Después de la hibridación, los embriones se incluyeron en OCT y se congelaron a -80 °. Se seccionaron bloques de COCT para obtener secciones transversales de la región del tronco y tubo neural con un espesor de 30 µm. Se tomaron imágenes de los embriones y las secciones con un microscopio confocal ZEISS LSM-880 con un aumento de 10 ×, 20 ×, un promedio de cuatro veces por cuadro y pilas en z de 10 µm. Las imágenes fueron procesadas con el software ImageJ. La función Plot Profile se utilizó para realizar la intensidad de la señal a lo largo de un eje definido por el usuario para cada canal fluorescente.

Se utilizó el protocolo Slide-seq V2 para generar todas las bibliotecas de secuenciación. Se realizaron síntesis de perlas, secuenciación de matrices, procesamiento de imágenes y llamada de bases33,39 como se describe a continuación. Brevemente, ChemGenes sintetizó internamente las perlas con código de barras de 10 μm con un código de barras espacial de 14 pb separado por una secuencia enlazadora de 14 pb, una secuencia de identificador molecular único (UMI) de 8 pb y una secuencia poli(T) de 20 pb. ) cola. Las matrices de perlas se prepararon resuspendiendo las perlas sintetizadas en dimetilsulfóxido al 10% a una concentración de 20.000 a 50.000 perlas por microlitro. Luego, se pipetearon 10 µl de la solución de perlas en cada posición de la junta. La junta cubreobjetos llena con solución de perlas se centrifugó a 750 g durante al menos 30 minutos a 40 °C hasta que la superficie estuvo seca. Para extraer los códigos de barras espaciales, se secuenciaron matrices utilizando celdas de flujo Bioptechs FCS2 con una bomba peristáltica RP-1 (Rainin) y un posicionador de válvula modular (Hamilton MVP). Durante la secuenciación, se utilizaron caudales entre 1 y 3 ml min-1. Las imágenes se obtuvieron con un objetivo Nikon Plan Apo 10×/0,45. La secuenciación se realizó mediante un enfoque de secuenciación por ligación. La llamada base desde las imágenes se realizó utilizando el paquete MATLAB personalizado PuckCaller (https://github.com/MacoskoLab/PuckCaller).

El protocolo completo para la preparación de la biblioteca Slide-seq V2 se puede encontrar en https://www.protocols.io/view/library-generation-using-slide-seqv2-81wgb7631vpk/v1?version_warning=no. Brevemente, las matrices cubiertas con secciones de tejido recién cortadas se transfirieron a tubos que contenían 6X SSC suplementados con inhibidor de ARNasa (concentración 1:20, número de catálogo 30281-2, NxGen, Lucigen) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, las matrices se sumergieron en tampón de transcriptasa inversa 1x y luego se transfirieron a tubos que contenían la mezcla de transcripción inversa (tampón de transcriptasa inversa Maxima 1x, desoxinucleósidos trifosfato (dNTP) 1 mM, 2 U ml-1 de inhibidor de RNasa, oligonucleótidos de cambio de plantilla 2,5 mM ( n.º de catálogo 339414YCO0076714, QIAGEN) y 10 U ml-1 Maxima H menos transcriptasa inversa) durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido de una incubación de 90 minutos a 52 °C. Se agregaron proteinasa K (concentración 1:50) y solución de limpieza de tejido al mismo tubo y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Luego se retiraron las perlas del portaobjetos de vidrio pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces y se resuspendieron en solución TE-TW (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, Tween 20 al 0,01%) y se sometieron a dos lavados TE-TW seguidos de 2 -centrifugación mínima a 3000g. Después de retirar el sobrenadante, las perlas se resuspendieron en 200 µl de una mezcla de exonucleasa I (20 µl de tampón ExoI 10X, 10 µl de ExoI, New England Biolabs) y se incubaron a 37 °C durante 50 minutos. Luego las perlas se lavaron dos veces en TE-TW, seguido de una incubación de 5 minutos en NaOH 0,1 N a temperatura ambiente y otro lavado con TE-TW. La síntesis de la segunda hebra se realizó en perlas añadiendo 200 µl de mezcla de la segunda hebra (tampón de transcripción inversa Maxima 1x, dNTP 1 mM, oligonucleótidos dN-SMRT de 10 mm, 0,125 U ml-1 fragmento de Klenow) e incubando a 37 °C durante 60 min. A continuación, las perlas se lavaron tres veces en TE-TW antes de la amplificación con PCR de amplificación del transcriptoma completo (1x tampón de mezcla de PCR Terra Direct, 0,25 U ml-1 de polimerasa Terra, cebador de mango de PCR TruSeq 2 mM y cebador de PCR SMART 2 mM) con el siguientes condiciones: 95 °C 3 min; 4 ciclos de 98 °C por 20 s, 65 °C por 45 s, 72 °C por 3 min y 9 ciclos de 98 °C por 20 s, 67 °C por 20 s, 72 °C por 3 min y 72 ° C durante 5 min. El producto de la PCR se limpió dos veces mediante inmovilización reversible en fase sólida 0,6X y se resuspendió hasta un volumen final de 10 µl. Luego, se cuantificó 1 µl de la biblioteca en un chip de ADN de alta sensibilidad Agilent Bioanalyzer o en una cinta de detección de ADN Agilent TapeStation High Sensitivity D500. Luego, se utilizaron 600 pg del producto de PCR como entrada para generar bibliotecas de secuenciación de Illumina mediante etiquetación con un kit Illumina Nextera XT (n.º de catálogo FC-131-1096). La biblioteca se amplificó con el índice de código de barras de las series TruSeq 5 y N700 con las siguientes condiciones: 72 °C durante 3 min; 95°C durante 30 s; 12 ciclos de 95 °C por 10 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 30 s y 72 °C por 5 min. Después de la limpieza, las bibliotecas finales se secuenciaron en celdas de flujo NovaSeq S2 o S4 con aproximadamente 300 millones de lecturas por matriz para embriones E8.5_Embryo_1 y E9.5, aproximadamente 200 millones de lecturas por matriz para E8.5_Embryo_2 y E9.0 y aproximadamente 50 millones lecturas por matriz para secciones transversales WT y Tbx6 KO.

Las lecturas secuenciadas se procesaron utilizando la tubería de herramientas Slide-seq (https://github.com/MacoskoLab/slideseq-tools) para generar la matriz de recuento de genes y hacer coincidir el código de barras de cuentas entre la matriz y las lecturas secuenciadas. La mayor parte del análisis posterior se realizó en R (v.4.1.0), excepto el análisis de velocidad del ARN realizado en Python (v.3.8.3, v.3.9.0, v.3.10). La matriz de recuento de genes y las coordenadas espaciales de las cuentas se procesaron utilizando Seurat (v.3.0.0, v.4.0.2)81. Se conservaron cuentas con más de 200 recuentos y menos del 20 % de recuentos de genes mitocondriales para análisis posteriores. Los datos de cada etapa se fusionaron debido al efecto de lote mínimo y se analizaron juntos. Para la replicación de E8.5 y los datos de E9.5, se utilizaron los 3000 genes altamente variables principales en FindVariableFeatures y los 40 componentes principales principales del análisis de componentes principales (PCA) (RunPCA de Seurat). Se utilizó la transferencia de etiquetas de Seurat para obtener la anotación del estado de la celda, con las funciones FindTransferAnchors y TransferData. Para la segunda réplica de E8.5 y los datos de E9.0, utilizamos la descomposición robusta del tipo de célula (RCTD)82 para anotar el estado de la célula porque es más sólida para reducir los recuentos de UMI. Los datos de la etapa E8.5 de nuestro estudio anterior se utilizaron como datos de referencia para la función de transferencia de etiquetas de Seurat y la función RCTD26. Los gráficos se generaron con ggplot2 (v.3.1.0).

Para obtener una mejor comprensión de los diferentes tipos de células en el cerebro de los embriones E9.5, realizamos agrupaciones de novo a partir de las cuentas correspondientes a las matrices de la etapa E9.5, anotando y refinando aún más las identidades utilizando el proceso Seurat (resolución = 1 ), y anotó manualmente cada uno de los 30 grupos utilizando genes marcadores conocidos y resultados de transferencia de etiquetas.

Primero, combinamos las velocidades espaciales de los genes marcadores para identificar genes expresados ​​dentro de los límites del cerebro, Fgf8 para el límite del rombencéfalo, Foxg1, Barhl2 y Wnt8b para el límite del telencéfalo-diencéfalo, y Barhl2 y Pax6 para el límite del diencéfalo-mesencéfalo. A continuación, calculamos la distancia entre cada cuenta y los límites y seleccionamos cuentas dentro de una distancia de 300 µm. Los genes cuya expresión se correlacionaba con la distancia a los límites del cerebro se identificaron utilizando un modelo de cuasi verosimilitud edgeR (v.3.34.1) (función glmQLFit)83. Los 40 genes principales clasificados según FDR se seleccionaron para la visualización del mapa de calor (mapa de calor complejo, v.1.99.5) en la Fig. 2c.

Las cuentas asociadas con el ojo en desarrollo se identificaron de forma semisupervisada. Primero, los genes correlacionados con los genes marcadores conocidos Rax, Vax1 y Six6 se extrajeron mediante análisis de coexpresión genética. Estos genes se utilizaron como insumo para el PCA y el proceso de agrupación en Seurat; Se utilizaron los 5 componentes principales principales. A continuación, utilizamos dbscan para refinar espacialmente los resultados de la agrupación y eliminar algunos valores atípicos en el grupo de ojos. Luego, comparamos el grupo de ojos con el grupo de prosencéfalo utilizando la función FindMarkers y buscamos nuevos genes marcadores expresados ​​específicamente en las regiones de los ojos en desarrollo.

La reconstrucción sc3D y el análisis asociado se describen en detalle en la Información complementaria y también se pueden encontrar en https://github.com/GuignardLab/sc3D.

Adaptamos el paquete scVelo (v.0.2.4)84 para analizar la velocidad del ARN en el eje espacial. Utilizando el tutorial en https://scvelo.readthedocs.io/, se extrajeron de los datos los recuentos exónicos e intrónicos de cada cuenta y se utilizaron como entrada. Se utilizó el modelo estocástico con parámetros predeterminados para calcular la velocidad de cada cuenta. A continuación, los vectores de velocidad se proyectaron al espacio físico. Para la visualización, los vectores de velocidad se calcularon de acuerdo con una cuadrícula de 50 × 50 μm; Se seleccionaron los 50 vecinos más cercanos en cada cuadrícula para calcular la velocidad promedio. La longitud de la velocidad con respecto a la velocidad de los cambios transcriptómicos se calculó tomando la longitud promedio del vector de velocidad de los vecinos (n = 50) de una cuenta. La confianza de la velocidad representa la coherencia de la dirección de la velocidad. Se calculó tomando la suma del ángulo coseno entre el vector velocidad y sus vecinos (n = 50). La función rank_velocity_genes se utilizó para identificar y clasificar genes que contribuyen al campo vectorial, lo que significa que los genes se transcriben activamente y tienen más ARNm naciente a medida que las células se diferencian.

Se seleccionaron cuentas anotadas como NMP, somitas y tubo neural de E8.5 y E9.5. A continuación, se descartaron las perlas con una puntuación de predicción inferior a 0,6 para eliminar las mezclas de células. Las cuentas restantes de E8.5 y E9.5 se integraron usando Harmony (v.0.1.0)85 con parámetros predeterminados; luego, se realizó la reducción de dimensionalidad de UMAP (runUMAP) en base a una matriz integrada. A continuación, utilizamos Monocle3 (v.1.0.0) para calcular el pseudotiempo a partir de la salida UMAP, según el tutorial y usando los parámetros predeterminados (https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/docs/trajectories/ ). Se utilizó un modelo lineal generalizado con estimadores de dispersión de cuasi verosimilitud de edgeR (v.3.34.1)83 para encontrar los genes que se correlacionaban con la trayectoria del pseudotiempo. Brevemente, al igual que con las instrucciones del tutorial86, utilizamos estimaDisp para estimar las dispersiones binomiales negativas genéticas, seguido de glmQLFit o glmQLFTest para probar genes que estaban significativamente correlacionados con el valor de pseudotiempo, que se usó como covariable en la matriz de diseño. Se seleccionaron genes con un FDR <0,01 y un cambio logarítmico superior a 0,05 y se representaron en un mapa de calor.

Después del análisis de la trayectoria en la región del tronco, la distancia por pares entre las cuentas dentro de cada estado celular se calculó en función de su distancia espacial y diferencia de pseudotiempo. Este análisis da como resultado la generación de matrices de distancia espacial y pseudotemporal. A continuación, se compararon y trazaron la distancia espacial y la distancia pseudotemporal de cada par.

Para este análisis se utilizaron las perlas asignadas para tener una identidad de tubo neural en la matriz E9.5_10. Usando Slingshot::slingshot (v.2.0.0)87, calculamos las curvas principales a partir de la ubicación espacial de las cuentas y ordenamos las celdas a lo largo de las curvas principales según su distancia anterior a posterior. La distancia de cada cuenta al casco convexo del tubo neural se calculó como la distancia dorsal a ventral y se dividió en ocho contenedores igualmente espaciados. Utilizamos SPARK (v.1.1.1) 88 con parámetros predeterminados para encontrar genes espacialmente variables. Tomamos la intersección de genes espacialmente variables de SPARK y los genes variables de Seurat como entrada para el análisis del módulo espacial. Se aplicó una distorsión dinámica del tiempo para encontrar genes con patrones espaciales coherentes que definimos como módulos (en el análisis de genes Hox). Para el análisis se utilizó el paquete Dtwclust (v.5.5.6) (https://CRAN.R-project.org/package=dtwclust) con la función tsclust (k = 8). El centroide de cada módulo se calculó como su patrón espacial. A continuación, utilizamos el mismo proceso de edgeR que el análisis de trayectoria para encontrar más genes correlacionados con cada patrón espacial. Seleccionamos genes con el mismo umbral y los visualizamos en un mapa de calor. Los genes Hox se agruparon como se describe en la sección anterior y la expresión promedio de cada módulo se suavizó utilizando la función gam::gam (v.1.2.0) para visualización. Para determinar las clases de proteínas que están enriquecidas en los genes diferencial y espacialmente variables, utilizamos PANTHER (v.17.0)89.

Los datos de las secciones transversales de embriones mutantes WT y Tbx6 se fusionaron y analizaron debido al bajo efecto del lote. El tubo neural y las regiones somitas se extrajeron en función de la expresión del gen marcador, las etiquetas del tipo de célula y la morfología del tejido. Debido al pequeño tamaño de la muestra, las perlas extraídas se procesaron utilizando el oleoducto Seurat con diferentes parámetros. Los parámetros utilizados fueron los siguientes: seleccionar 1.000 genes utilizando la función FindVariableFeatures; utilice los primeros 20 componentes principales en la función FindNeighbors; y considere 15 vecinos en el cálculo de k vecinos más cercanos, utilizando una resolución de 0,8 en la función FindClusters y configurando n.neighbors = 20, min.dist = 0,3 en la función RunUMAP. Después de la agrupación de novo, anotamos cada grupo según sus genes marcadores y excluimos el grupo 0 porque contenía principalmente cuentas de baja calidad. Los grupos 4 y 5 correspondieron a la cresta neural y la placa neural, respectivamente, lo que descarta un análisis posterior. Calculamos la densidad espacial ráster de cada grupo usando MASS::kde2d (v.7.3–54) y los combinamos tomando la densidad más alta para cada posición, que se representa en la Fig. 5b. Mapeamos los datos de los mutantes WT y Tbx6 al conjunto de datos del tronco E9.5 como referencia calculando su vecino más cercano mutuo utilizando el método rápido de corrección mutua de vecinos más cercanos90. Para cada cuenta en los datos del mutante Tbx6, seleccionamos sus diez vecinos más cercanos en el espacio PCA integrado como anclajes. Calculamos la varianza de la matriz de dimensionalidad reducida de los vecinos como una métrica de incertidumbre de proyección. Las coordenadas UMAP promediadas de diez vecinos más cercanos para cada cuenta se proyectaron en la UMAP de referencia, representando el tamaño la incertidumbre de la proyección. La función FindAllMarkers se utilizó para encontrar los genes marcadores para cada grupo. Luego aplicamos la función FindMarkers para comparar dos grupos (somita versus tubo neural central y tubo neural central versus tubo neural ectópico), con el cambio de cada gen.

Todos los intentos de replicar las observaciones tuvieron éxito (como se indica a continuación). Se realizó una preselección de muestras, si se indica (a continuación). No se excluyeron muestras ni datos del análisis, a menos que se indique lo contrario en los Métodos. Todas las comparaciones (Tbx6 KO) se realizaron con muestras de control del mismo experimento. La secuenciación y el procesamiento y análisis posteriores fueron independientes de la intervención humana. El cegamiento no fue relevante porque éste no fue un estudio de intervención; Las tuberías se ejecutaron de manera uniforme en todas las muestras, lo que permitió un análisis imparcial. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra, pero nuestras muestras son similares a las reportadas en publicaciones anteriores29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

Se utilizó una prueba de suma de rangos de Wilcoxon bilateral para identificar genes marcadores y se utilizó la corrección de Bonferroni para las comparaciones múltiples en la Fig. 2c, Datos ampliados, Figs. 6d y 10f, Tablas complementarias 5 y 6, y Tablas complementarias 8 y 9. Todas las demás pruebas se describen en las leyendas de las figuras. Los valores de FDR y P utilizados (FDR <0,01 y cambio logarítmico superior a 0,05) se indican en las leyendas.

En la figura 4c de datos ampliados, los elementos de los diagramas de caja son los siguientes: línea media, mediana; límites del diagrama de caja, cuartiles superior e inferior; bigotes

Los experimentos Slide-seq con embriones WT se realizaron en dos E8.5 completos, un E9.0 y 13 secciones parciales de tres embriones en la etapa E9.5. Los embriones se obtuvieron de al menos tres experimentos de aislamiento independientes y se organizaron para el recuento de somitas (etapa de 3 a 5 pares de somitas para E8.5; etapa de 10 a 12 pares de somitas para E9.0; etapa de 15 a 18 pares de somitas para E9.5). que son los embriones representativos que se muestran en los datos ampliados, figura 1a. El experimento Slide-seq con embriones WT y Tbx6 KO se realizó en una sección transversal (WT) y dos (Tbx6 KO). El experimento Tbx6 KO se realizó de forma independiente cinco veces (en total) para verificar el fenotipo, que se reprodujo en cada embrión en todos los experimentos. Las secciones se obtuvieron de la parte posterior del tronco (la imagen representativa de la sección recopilada antes de Slide-seq se muestra en la Fig. 5a). La hibridación in situ de montaje completo se realizó una vez en embriones en etapa WT E9.5 para el número indicado (n = 3) y mostró resultados reproducibles (Datos ampliados, Fig. 2b). Los experimentos de RNA-FISH se realizaron a partir de dos de los experimentos independientes con el número indicado (n = 3 embriones) y mostraron resultados reproducibles, con una imagen representativa que se muestra en las figuras de datos extendidos. 5c, 7f, 9f y 10g, y las Figs. 4e y 5e.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos sin procesar y procesados ​​se pueden descargar desde Gene Expression Omnibus con el número de acceso. GSE197353. Se puede descargar el objeto de entrada para la visualización 3D de los siguientes embriones: E8.5_Embryo1 (https://figshare.com/s/1c29d867bc8b90d754d2); E8.5_Embryo2 (https://figshare.com/articles/dataset/E8_5_Embryo2_h5ad/21695849/1); E9.0 (https://figshare.com/articles/dataset/E9_0_Embryo_h5ad/21695879/1). Las matrices Slide-seq individuales se pueden visualizar en https://cellxgene.cziscience.com/collections/d74b6979-efba-47cd-990a-9d80ccf29055. Las secuencias y plásmidos de la sonda de hibridación in situ de montaje completo están disponibles en http://mamep.molgen.mpg.de, con los números de acceso y las secuencias que se muestran en la Tabla complementaria 10. Los códigos de acceso de la sonda FISH se pueden encontrar en la Tabla complementaria 10. Completo Las secuencias de sondas son propiedad de Molecular Instruments. Consulte la Nota complementaria para obtener detalles sobre tutoriales e información adicional para el usuario de sc3D.

El código utilizado para reproducir los análisis está indexado en https://github.com/GuignardLab/sc3D para la reconstrucción 3D sc3D y https://github.com/LuyiTian/Embryo_Slideseq_analysis para el análisis E9.5. El embrión 3D se puede visualizar con sc3D-viewer siguiendo las instrucciones detalladas proporcionadas (https://github.com/GuignardLab/napari-sc3D-viewer). Se puede acceder a PuckCaller en https://github.com/MacoskoLab/PuckCaller.

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Descargar referencias

Agradecemos a los miembros de los laboratorios Meissner, Chen y Macosko por su discusión crítica y sus comentarios. Agradecemos a M. Scholz-Wittler y B. Hermann por compartir plásmidos del Proyecto de Anatomía Molecular del Embrión de Ratón para los experimentos de hibridación in situ. Agradecemos a J. Fiedler, M. Peetz, A. Landsberger y C. Franke de la unidad de animales transgénicos del Instituto Max Planck de Genética Molecular por su apoyo en el trabajo con animales. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck (AM). LG recibió financiación del programa Investissements d'Avenir del gobierno francés gestionado por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-16-CONV-0001) y de la Iniciativa de Excelencia de la Universidad de Aix-Marseille—A*MIDEX. FC reconoce el apoyo del Premio a la Independencia Temprana de los Institutos Nacionales de Salud (DP5, 1DP5OD024583), el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (R01, R01HG010647), el premio CASI del Fondo Burroughs Wellcome, la Fundación Searle Scholars, el Instituto de Células Madre de Harvard y Merkin Instituto.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Sociedad Max Planck.

Estos autores contribuyeron igualmente: Abhishek Sampath Kumar, Luyi Tian, ​​Adriano Bolondi.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Evan Z. Macosko, Léo Guignard, Fei Chen, Alexander Meissner.

Departamento de Regulación del Genoma, Instituto Max Planck de Genética Molecular, Berlín, Alemania

Abhishek Sampath Kumar, Adriano Bolondi, Amèlia Aragonés Hernández, Helene Kretzmer, Maria Walther, Gabriel Barakat, Leah Haut, Yechiel Elkabetz & Alexander Meissner

Instituto de Biotecnología, Universidad Técnica de Berlín, Berlín, Alemania

Abhishek Sampath Kumar

Broad Institute del MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Luyi Tian, ​​Robert Stickels, Evan Murray, Evan Z. Macosko, Fei Chen y Alexander Meissner

Instituto de Química y Bioquímica, Universidad Libre de Berlín, Berlín, Alemania

Amelia Aragonés Hernández, Leah Haut & Alexander Meissner

Escuela de Graduados en Artes y Ciencias, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Robert Stickels

Departamento de Genética del Desarrollo, Instituto Max Planck de Genética Molecular, Berlín, Alemania

Lars Wittler

Departamento de Psiquiatría, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA, EE. UU.

Evan Z. Macosko

Universidad Aix de Marsella, Universidad de Toulon, Centro Nacional de Investigación Científica, Laboratorio de Sistemas y Ciencias de la Computación 7020, Centro Turing para Sistemas Vivos, Marsella, Francia

Leo Guignard

Departamento de Células Madre y Biología Regenerativa, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Fei Chen y Alexander Meissner

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ASK, AB, EZM, FC y AM conceptualizaron el estudio. ASK, LT y RS realizaron los experimentos Slide-seq con la ayuda de AB y EMLT realizó el análisis de datos con la ayuda de ASK, HK, AB y AAHAAH y YE proporcionó comentarios críticos sobre el análisis de las regiones del cerebro. LG conceptualizó, desarrolló y supervisó la reconstrucción y el análisis 3D. ASK y LW realizaron experimentos con animales transgénicos. ASK realizó la hibridación in situ y los experimentos de ARN-FISH con la ayuda de MW, GB y LHAM, FC y EZM supervisaron el estudio. ASK, AB y AM escribieron el manuscrito con aportes críticos de todos los autores.

Correspondencia a Alexander Meissner.

EZM y FC son consultores remunerados de Atlas Biologicals. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Genetics agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a. Imágenes de campo claro de embriones representativos aislados de 3 ratones adoptivos independientes y preparados para las respectivas etapas de desarrollo. Barra de escala, 500 µm. b. Distribución de cuentas perfiladas por Slide-seq de las respectivas etapas. C. Gráficos de violín que muestran el número de UMI o genes recuperados por cuenta. Los valores Log10 se utilizan para representar recuentos. UMI, identificador molecular único. d. Gráficos de violín que muestran la cantidad de UMI y genes recuperados por cuenta en matrices individuales. Los valores Log10 se utilizan para representar recuentos. UMI, identificador molecular único. mi. Aproximación y proyección de colector uniforme (UMAP) de datos de Slide-seq y atlas de referencia de scRNA-seq 10X de gastrulación de ratón26. El color de las cuentas corresponde al estado celular previsto y anotado. Recuadro: representación UMAP de cuentas cubiertas por las modalidades indicadas (rojo). Cada punto representa una cuenta o una celda. F. UMAP de datos integrados de las etapas E6.5 a E9.5. Las cuentas negras representan células/cuentas de la etapa correspondiente. Cada punto representa una cuenta o una celda.

a. Conjunto representativo de tronco/torácico (conjunto E9.5_2) con estados de celda resaltados proyectados espacialmente. Cada punto representa una cuenta. Los contornos se utilizan para enfatizar las características morfológicas. Una, anterior; P, posteriores; D, dorsales; V, ventral. Barra de escala, 200 μm b. Comparación de Slide-seq y la hibridación in situ de montaje completo convencional para patrones de expresión génica. Gráfico de expresión genética espacial que muestra la expresión de Ttn (corazón), Sox2 (tubo neural), T (mesodermo del cogollo) y Meox1 (somitas). La escala de colores representa la expresión genética normalizada. n/n en el panel de hibridación in situ de montaje completo indica el número de embriones que exhiben el patrón con respecto al número total de embriones analizados (de un experimento). Cada punto representa una cuenta. Barra de escala, 200 μm. C. Distribución de estados de celda de grupos anotados en las matrices E9.5 individuales. Los colores representan estados de celda individuales, leyenda en el panel (d). d. Proyección espacial de estados celulares anotados en matrices de embriones E9.5. El panel muestra matrices que cubren las regiones del tronco/torácica y de la cabeza. Cada color corresponde a un estado celular distinto. Cada punto representa una cuenta. Barra de escala, 200 μm. Una, anterior; P, posteriores; D, dorsales; V, ventral; R, rostral; C, caudales. mi. Distribución del estado celular de los grupos anotados en matrices individuales de los dos embriones completos en etapa E8.5 perfilados independientemente. Los colores representan estados de celda individuales según la leyenda en el panel (d). F. Distribución del estado celular de estados individuales en 10X scRNA-seq reference26 y Slide-seq en la etapa E8.5 (panel izquierdo), y la comparación entre los dos embriones E8.5 completos perfilados por Slide-seq (panel derecho).

a, b. Proyección espacial de estados celulares en matrices individuales de los dos embriones E8.5 completos. Cada punto corresponde a una cuenta. Cada color representa un estado de celda. Barra de escala, 200 μm. cd. Los volúmenes de los tejidos indicados se clasificaron de mayor a menor, calculados a partir del embrión virtual 3D E8.5 y E9.0. Los volúmenes de tejido se enumeran en la Tabla complementaria 2. e. Volumen relativo de cada tejido en los dos embriones E8.5 completos. F. Desacuerdo entre los sectores iniciales y omitidos al aumentar la distancia entre los sectores individuales.

a, b. Comparación de precisión y tiempo de procesamiento (sc3D vs PASTE) entre diferentes conjuntos de datos. C. Diagrama de caja de las distancias por pares entre las cuentas en las imágenes registradas correctamente y las generadas por el algoritmo cuando los cortes están separados por 60, 90, 120, 150, 180, 210 µm ('n' pares de cortes: 6,4,3,3 ,2,1, respectivamente). Elementos del diagrama de caja: línea media, mediana; límites del diagrama de caja, cuartiles superior e inferior; bigotes, desviación estándar. d. Diagrama de barras de la superposición de genes localizados en los tejidos de los dos embriones completos E8.5 individuales. La lista completa de genes se puede encontrar en la Tabla complementaria 3. e. Diagrama de barras de la fracción de genes localizados en las matrices 2D individuales que estaban entre los 10 genes localizados mejor clasificados en el volumen 3D de los tejidos respectivos en todos los tejidos del embrión E8.5 (se muestra el análisis de E8.5_Embryo_1). Las barras de error indican la desviación estándar de los genes entre los cortes 2D y el volumen 3D (n = 13 genes). fg. Mapa de calor de los genes más localizados (normalización de puntuación z de fila) en los tejidos indicados en el embrión E8.5 embrion_1 (f) y E9.0 (g).

a. Vista 3D del embrión E8.5 que resalta el volumen del tejido cardíaco (en rosa). Cada punto corresponde a una cuenta. El punto de vista se indica con el símbolo del ojo (amarillo o azul). b. Diagrama de dispersión que muestra los genes más localizados en el volumen de tejido cardíaco. La escala de colores corresponde a una puntuación de localización que oscila entre 0,06 (rojo claro) y 0,30 (rojo oscuro). Cada punto representa un gen. La localización espacial de los genes resaltados se muestra en c. El eje x muestra la densidad de expresión génica y el eje y muestra el volumen relativo de expresión dentro del tejido. C. vISH de genes localizados, Nppa, Cck, Sfrp5 y Tdgf1. La escala de colores indica los valores de expresión genética normalizados que van del mínimo al máximo para cada gen. Cada punto corresponde a una cuenta. El punto de vista se indica con el símbolo del ojo (amarillo o azul). RNA-FISH en el embrión E9.0 muestra la localización distinta de Tdgf1 en el corazón. Barra de escala, 100 µm. d. vISH que muestra la coexpresión genética de Cck (magenta) y Sfrp5 (verde) en el tejido cardíaco. Cada punto corresponde a una cuenta. La escala de colores de cada gen varía del negro al magenta o del negro al verde. Las perlas doblemente positivas se muestran en blanco. mi. vISH para genes espacialmente ubicuos en el estado "sangre primitiva tardía". Barra de escala, 200 µm. Una, anterior; P, posteriores; D, dorsales; V, ventral; L, izquierda; R, cierto.

a. Gráfico espacial de los grupos/estados anotados en la región del cerebro de un embrión en etapa E9.5 (matriz E9.5_5). Cada punto corresponde a una cuenta. Cada color representa el estado de la celda anotado. Barra de escala, 200 µm. b. Gráfico espacial de expresión genética que representa los genes indicados de las categorías mencionadas. Cada punto representa una cuenta. La escala de colores representa la expresión genética normalizada. Barra de escala, 200 µm. La matriz que se muestra es E9.5_3. C. Diagrama de puntos que muestra la expresión de genes del mesencéfalo y del rombencéfalo (anotados25 en los grupos del mesencéfalo y del rombencéfalo en este estudio). El tamaño del punto representa el porcentaje de células que expresan los genes y el color indica la expresión genética normalizada. d. Gráfico de volcán de los genes expresados ​​diferencialmente entre el cerebro medio y el rombencéfalo anotados (este estudio). Cada punto representa un gen, los puntos en gris están por debajo del umbral de significancia (genes filtrados por FDR <0,01 y logFC>0,2; prueba de suma de ejecución de Wilcoxon bilateral). mi. Gráfico de expresión esquemática y espacial que distingue las regiones del diencéfalo/mesencéfalo dorsal y ventral. Shh marca el dominio ventral, mientras que Fzd10 (receptor Wnt) marca la parte dorsal. Cada punto representa una cuenta. La escala de colores representa la expresión genética normalizada. Barra de escala, 100 µm. D, dorsales; V, ventral; R, rostral; C, caudales.

a. La longitud de la velocidad espacial (izquierda) y la confianza de la direccionalidad (derecha) resaltan regiones con diferentes dinámicas. Barra de escala, 200 µm. La matriz que se muestra es E9.5_3. b. La combinación de la medición de longitud y confianza da como resultado regiones de velocidad "baja" y "alta". Las regiones con velocidad "baja" muestran una longitud y una direccionalidad más bajas. Las regiones con velocidad "alta" muestran mayor longitud y direccionalidad del vector. La barra de escala es de 200 µm. La matriz que se muestra es E9.5_3. C. Regiones insertadas de la velocidad del ARN en la región del cerebro con expresión de marcadores que definen las respectivas regiones límite (representantes de 3 matrices E9.5 independientes). Cada punto corresponde a una cuenta. La escala de colores denota expresión normalizada. Barra de escala, 50 µm. d. Gráfico espacial de genes WNT en R2 (límite telencéfalo-diencéfalo - flechas indicadas; representativo de 3 matrices E9.5 independientes). Cada punto corresponde a una cuenta. La escala de colores denota expresión normalizada. Barra de escala, 50 µm. mi. Esquema basado en Slide-seq del ojo en desarrollo. El prosencéfalo (azul oscuro) y el ojo (naranja) se representan con la fracción de cuentas correspondiente a cada estado (gráfico de barras). 1499/4824 cuentas para el prosencéfalo/tubo neural anterior; 105/4824 perlas para el ojo/tubo neural anterior; y 105/1499 cuentas para el ojo/prosencéfalo. Gráfico espacial que muestra la expresión del marcador específico del ojo Six6. Una, anterior; R, rostral; C, caudales; D, dorsales; V, ventral. F. Gráficos espaciales que muestran la expresión de dos genes marcadores oculares recientemente identificados, Cp y Vwc2 (izquierda: matriz E9.5_3 completa; medio: subconjunto del 'ojo'; derecha: validaciones de RNA-FISH para Cp y Vwc2 (magenta) y núcleos contrateñidos (gris) se muestran para un embrión representativo (n = 3 embriones/experimento, 3 experimentos independientes). Barra de escala, 200 µm. R, rostral; C, caudales; D, dorsales; V, ventral.

a. Gráfico espacial que muestra cuentas del embrión E9.5 (matriz E9.5_6) correspondientes a los grupos de NMP, PSM, somitas y tubo neural (panel izquierdo) y los valores de pseudotiempo correspondientes (panel derecho). Cada punto corresponde a una cuenta. Los estados de las celdas se resaltan en los colores indicados. Barra de escala, 200 µm. b. Mapa de calor que muestra la expresión de genes determinantes del pseudotiempo a lo largo de las trayectorias somíticas y neuronales. Los genes utilizados para el mapa de calor se enumeran en la Tabla complementaria 6. c. Gráfico de líneas que muestra la expresión genética de genes seleccionados a lo largo de las trayectorias neurales y somíticas. El eje y representa la expresión genética escalada. d. Flujo de trabajo esquemático de la herramienta 'perfilado de ejes'. mi. Gráfico circular que muestra genes expresados ​​diferencialmente a lo largo del eje anteroposterior divididos por función celular y molecular. Los genes se enumeran en la Tabla complementaria 7. f. Gráfico de líneas que muestra la distribución espacial a lo largo del eje anteroposterior de la expresión de los módulos de Hox (I-VI). gramo. vISH para genes Hox en embrión en etapa E9.0 virtual 3D. Barra de escala, 200 µm. D, dorsales; V, ventral; Una, anterior; P, posterior.

a. Mapa de calor que muestra los 160 genes principales con regionalización de expresión génica en uno de los ocho contenedores generados a lo largo del eje dorsoventral (genes filtrados por FDR <0,01 y logFC>0,05 luego clasificados por FDR). A la derecha se resalta un conjunto seleccionado de genes previamente conocidos asociados con el patrón dorsoventral (negro). Las estructuras específicas a lo largo del eje se resaltan en la parte inferior del mapa de calor. Los genes están normalizados con puntuación z de fila y se enumeran en la Tabla complementaria 7. b. Mapa de calor que muestra la puntuación z escalada en columna de los coeficientes de correlación de Pearson que comparan los contenedores dorsoventrales de Slide-seq y los grupos identificados a partir de una referencia unicelular del tubo neural26. RP, placa de techo; dp, progenitores dorsales; pMN, progenitores de neuronas motoras; Chimenea, piso de placa. C. Mapa de calor que muestra un subconjunto extendido de los genes que muestran la regionalización de la expresión génica en uno de los ocho contenedores generados a lo largo del eje dorsoventral (genes filtrados por FDR <0,01 y logFC>0,05 luego clasificados por FDR). Las estructuras específicas a lo largo del eje se resaltan en la parte inferior del mapa de calor. Los genes están normalizados con puntuación z de fila y se enumeran en la Tabla complementaria 7. d. Gráfico circular que muestra genes expresados ​​diferencialmente a lo largo del eje dorsoventral divididos por función celular y molecular. Los genes se enumeran en la Tabla complementaria 7. e. Gráficos esquemáticos (panel superior) y espaciales de expresión génica de los genes de patrones del tubo neural conocidos en la matriz E9.5_2. Cada punto denota una cuenta. La escala de colores representa la expresión genética normalizada. D, dorsales; V, ventral; Una, anterior; P, posterior. F. Cuantificaciones de RNA-FISH y Slide-seq para cada gen perfilado de la Fig. 4e. Los genes están normalizados con puntuación z bin (magenta: RNA-FISH; naranja: Slide-seq). D, dorsales; V, ventral.

a. Esquema de la estrategia de ablación del gen Tbx6. Los ARN guía se dirigen a los exones indicados. UTR, región no traducida. b. Esquema que muestra el plano de crioseccionamiento para el experimento Slide-seq. C. Gráfico espacial de todos los estados de las células en los conjuntos transversales troncales completos WT y Tbx6-KO. Las líneas de puntos indican la región que se utilizó para análisis posteriores. Cada punto corresponde a una cuenta. Cada color representa un estado individual. Barra de escala, 200 µm. d. UMAP, gráfico espacial y fraccionario que muestra los estados celulares filtrados y anotados de novo. mi. Gráfico de puntos que representa la expresión de genes marcadores somíticos y del tubo neural en los grupos de somitas, tubo neural 1 y 2. El tamaño de los puntos representa el porcentaje de células que expresan el gen y el color representa el nivel de expresión normalizado promedio del grupo. F. Diagrama de dispersión que muestra genes expresados ​​diferencialmente entre grupos de tubos somíticos frente a grupos de tubos centrales y grupos de tubos centrales frente a ectópicos (genes filtrados por FDR <0,01. Lista completa de genes en la Tabla complementaria 9. g. RNA-FISH de Foxa2 y Pax6 en una sección transversal del tubo neural en embriones WT y Tbx6-KO. El esquema representa la posición anteroposterior donde se perfilaron las secciones transversales. Barra de escala, 50 µm. D, dorsal; V, ventral; WT, tipo salvaje; KO, knockout.

Higos suplementarios. 1 y 2, Métodos y Notas sobre la visualización de datos disponibles.

Tablas complementarias 1 a 10.

Vista 3D de E8.5_Embryo1.

Vista 3D de E8.5_Embryo2.

Vista 3D de E9.0.

vISH e hibridación in situ de montaje completo de genes localizados (corazón y cerebro) en E8.5_Embryo2.

vISH 3D de genes localizados en el corazón en embrión E8.5_1.

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Reimpresiones y permisos

Sampath Kumar, A., Tian, ​​L., Bolondi, A. et al. Mapas transcriptómicos espaciotemporales de embriones completos de ratón al inicio de la organogénesis. Nat Genet 55, 1176-1185 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01435-6

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Recibido: 10 de febrero de 2023

Aceptado: 25 de mayo de 2023

Publicado: 06 de julio de 2023

Fecha de emisión: julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-023-01435-6

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