Espesor de corte óptimo para mejorar la precisión del análisis cuantitativo de la distribución de microesferas y células fluorescentes en crio

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 10907 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

La crioimagen se ha utilizado eficazmente para estudiar la biodistribución de células o microesferas fluorescentes en modelos animales. Las imágenes fluorescentes secuenciales, corte por corte, permiten la detección de células o microesferas fluorescentes para la cuantificación correspondiente de su distribución en el tejido. Sin embargo, si los sectores son demasiado finos, se producirá una sobrecarga de datos y tiempos de análisis excesivos. Si las rodajas son demasiado gruesas, es posible que se pasen células por alto. En este estudio, desarrollamos un modelo para la detección de células o microesferas fluorescentes para ayudar a la determinación óptima del espesor del corte. Los factores clave incluyen: espesor de la sección (X), intensidad de las células fluorescentes (Ifluo), coeficiente de atenuación eficaz del tejido (μT) y umbral de detección (T). El modelo sugiere un valor de espesor de corte óptimo que proporciona una sensibilidad casi ideal y al mismo tiempo minimiza el tiempo de exploración. El modelo también sugiere un método de corrección para compensar las celdas perdidas en el caso de que los datos de la imagen se adquirieran con un grosor de corte demasiado grande. Este enfoque permite a los operadores de crioimagen utilizar cortes de mayor espesor para acelerar el tiempo de exploración sin una pérdida significativa del recuento de células. Validamos el modelo utilizando datos reales de dos estudios independientes: microesferas fluorescentes en un corazón de cerdo y células madre marcadas con fluorescencia en un modelo de ratón. Los resultados muestran que las relaciones entre el grosor del corte y la sensibilidad de detección de las simulaciones y los datos reales coincidieron bien con una correlación del 99 % y un error cuadrático medio (RMS) del 2 %. También discutimos las características de detección en situaciones donde no se cumplieron los supuestos clave del modelo, como la variación de la intensidad de la fluorescencia y la distribución espacial. Finalmente, mostramos que con la configuración adecuada, la crioimagen puede proporcionar una cuantificación precisa de la biodistribución de células fluorescentes con índices de recuperación notablemente altos (número de detecciones/entrega). Dado que la tecnología de crioimagen se ha utilizado en muchas aplicaciones biológicas, nuestros métodos óptimos de determinación del espesor de corte y corrección de datos pueden desempeñar un papel crucial para seguir avanzando en su usabilidad y confiabilidad.

La crioimagen es una tecnología de imágenes microscópicas en 3D que permite la localización de células fluorescentes en todas partes de un ratón o rata completo con sensibilidad de una sola célula1,2,3,4,5,6,7,8,9. El sistema consta de un microtomo criostato motorizado, un microscopio con capacidades de campo claro y fluorescente, un posicionador robótico y un software de control. Para realizar crioimagen, los tejidos de interés se congelan instantáneamente usando nitrógeno líquido y se fijan en una etapa de corte y se emplea seccionamiento e imagen alternados. El sistema adquiere imágenes del tejido en mosaico, de gran campo de visión, de alta resolución (~ 10 µm), de campo claro en color y fluorescentes. Al apilar cortes de imágenes, se pueden generar volúmenes de imágenes en 3D para la visualización y el análisis de la biodistribución. Estas características excepcionales hacen que la crioimagen sea única en comparación con otras modalidades 3D in vivo, como la resonancia magnética (MRI) o la bioluminiscencia (BLI). Si bien estas modalidades de imágenes in vivo pueden obtener imágenes de un animal completo, carecen de la resolución adecuada y solo pueden producir imágenes en escala de grises. Con las características antes mencionadas, la crioimagen aborda una brecha crítica en otras modalidades de imágenes de investigación biológica.

La crioimagen se ha utilizado para estudiar la biodistribución de células o microesferas fluorescentes en varios modelos animales, incluidos pequeños roedores2,3,4,6,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20, perros7,21, cerdos5,22,23 y otros modelos animales24. Burden-Gulley et al.13,14,15 utilizaron crioimagen para visualizar comportamientos migratorios e invasivos de las células de glioblastoma en un modelo de ratón. Recientemente, desarrollamos una plataforma basada en crioimagen para cuantificar y evaluar metástasis fluorescentes en todo el cuerpo del ratón4,17,18,19. Se descubrió que la plataforma era adecuada para la evaluación y optimización de líneas de tecnologías (agentes de imágenes, métodos de imágenes, terapias, modelos tumorales, etc.) que son esenciales para detectar, comprender y tratar el cáncer metastásico. Muchos grupos7,8,24,25, incluido el nuestro5,26, emplearon la tecnología para resolver espacialmente la perfusión miocárdica 3D cuantitativa y de alta resolución mediante el método de atrapamiento de microesferas fluorescentes. Van Horsen en el. También utilizaron la tecnología para visualizar la biodistribución de microesferas fluorescentes7,21,22,23,27 y monocitos marcados fluorescentemente6 para investigar las propiedades de la progresión de la neovascularización coronaria en corazones de animales. Además, previamente hemos utilizado tecnología de crioimagen para estudiar la biodistribución corporal total de células madre inyectadas por vía intravenosa y células inmunitarias inductoras de enfermedades en un modelo de ratón con enfermedad de injerto contra huésped (EICH)2,3,9,10,11,12 ,20,28,29. En el documento complementario se muestran ejemplos de imágenes fluorescentes que muestran las señales de microesferas y las señales de células madre. Dada la gran utilidad de la crioimagen en la investigación de imágenes biomédicas, ha habido cada vez más aplicaciones que utilizan esta tecnología.

Aunque la crioimagen se ha utilizado ampliamente, no se había identificado antes el valor óptimo del grosor del corte. En algunos experimentos que requieren imágenes de un tejido grueso (por ejemplo, corazón de cerdo), a menudo se elige un valor grande de espesor de sección (por ejemplo, X > 100 µm). Los beneficios de un espesor de sección mayor incluyen tiempos de procesamiento e imágenes más rápidos, menor uso de memoria y una vida útil más larga de la cuchilla seccionadora. Sin embargo, es posible que las señales de células ligeramente fluorescentes incrustadas en un tejido grueso no lleguen a la superficie y no sean detectadas por el sistema de imágenes. La física de la pérdida de señal puede describirse mediante los principios de absorción y dispersión de la luz en el tejido biológico30,31,32,33. En general, al establecer un grosor de corte demasiado grande, se puede esperar una tasa significativa de falsos negativos. Esto haría que los resultados no fueran confiables, particularmente en aplicaciones que exigen una cuantificación absoluta precisa. Por otro lado, si se establece que el espesor del corte sea demasiado pequeño, aunque se puede obtener una cuantificación precisa, no sería eficiente desde el punto de vista computacional ni económico. Por ejemplo, un tejido del que se pueden obtener imágenes durante la noche (12 h) con un grosor de corte de 120 m tardará 3 días (72 h) en escanearse a 20 m. Se espera que haya un valor óptimo para el grosor del corte que proporcione un recuento preciso de células/microesferas en un tiempo de escaneo razonable.

En este estudio, proponemos un modelo para estimar el espesor de corte óptimo, que es el corte más grueso que mantiene recuentos celulares precisos. Validamos el modelo con datos y determinamos por primera vez la relación entre el grosor del corte y la detectabilidad. Luego comparamos los resultados entre datos simulados y datos reales para determinar su grado de correlación.

El modelo se desarrolla principalmente a partir de un estudio previo sobre la eliminación de señales fluorescentes fuera del plano34. Se supone que las células fluorescentes están incrustadas en un volumen de tejido homogéneo (Fig. 1). Al realizar la crioimagen, se secciona la fina capa superior del volumen. Luego se adquieren imágenes de la cara del bloque restante mediante imágenes de epifluorescencia, y la intensidad de la señal detectada se determina de acuerdo con las propiedades ópticas del tejido. El modelo tiene como objetivo determinar si el sistema de imágenes puede detectar señales de las células fluorescentes debajo de la superficie expuesta (cara de bloque).

Modelo de imágenes de epifluorescencia. La figura (A) muestra que una célula marcada con fluorescencia (círculo amarillo) está incrustada en un tejido homogéneo (cuadro verde). La luz de excitación/incidente de una fuente de luz fluorescente viaja desde un microscopio arriba (trapezoide naranja) y luego interactúa con el fluoróforo de las células. La luz emitida viaja de regreso a la cámara donde se determina si la señal celular es detectada o no mediante un umbral de detección. El modelo se puede simplificar aún más a la figura (B).

Supongamos que los fotones de una fuente de luz fluorescente, con una intensidad I0, inciden sobre la cara del bloque de la muestra (Fig. 1). En la interfaz aire-espécimen, una fracción de la luz incidente se transmite al tejido, Tat, dependiendo del índice de refracción de la cara del bloque. Los fotones de excitación que ingresan a la muestra se absorben y se dispersan en el tejido con un coeficiente de atenuación tisular efectivo μex (cm-1). Los fotones transmitidos continúan a través del tejido hasta que inciden en un fluoróforo a una profundidad x debajo de la superficie. Una fracción, F, de estos fotones incidentes es absorbida por el fluoróforo y da como resultado una emisión fluorescente de fotones con una energía más baja (desplazamiento de Stokes) en la dirección del sistema de imágenes. Los fotones emitidos se dispersan y absorben dentro del tejido con otro coeficiente de atenuación tisular efectivo μem (cm-1), y un porcentaje se transmite en la interfaz tejido-aire, Tta. La señal fluorescente detectada en el detector tiene intensidad I(x). Por lo tanto, la intensidad fluorescente I(x) que emite un fluoróforo a una profundidad x del tejido se describe mediante:

Suponiendo que μT = μex + μem e Ifluo = I0TatFTta, podemos simplificar aún más el modelo para:

donde I (x) es la intensidad detectada por la cámara, Ifluo es la intensidad del fotón fluorescente que se transmite desde los fluoróforos sin atenuación y μT es el coeficiente de atenuación total del tejido (Fig. 1B). A diferencia de algunos informes anteriores7,27,32, no separamos explícitamente la contribución de la dispersión, en forma de función de dispersión puntual, del término de atenuación en este modelo simplificado de propagación de la luz. Más bien combinamos los efectos de la dispersión de la luz y la atenuación del tejido en un único término exponencial. Esta suposición es consistente con la ley de Lambert-Beer y otros modelos de propagación de luz 1D en tejido31,33,34. Dado que solo consideramos el cambio de intensidad a lo largo de una línea recta entre el sistema de cámara y el centro del fluoróforo incrustado en el tejido, solo hay un parámetro espacial en nuestro modelo (x), que representa una distancia desde la superficie (x = 0 ) al fluoróforo.

A continuación, para que se detecte la señal de la célula fluorescente, la intensidad del fotón emitido que llega a la cámara, I(x), debe ser mayor o igual a un umbral de detección, T, dando:

En la crioimagen, la muestra de tejido se corta alternativamente y se obtienen imágenes con un espesor de sección fijo1,2,4,10,15,18. Los diagramas de la Fig. 2 ilustran cómo se adquieren las crioimágenes. La muestra de tejido, que contiene una célula fluorescente, puede moverse hacia adelante y hacia atrás entre la posición de obtención de imágenes y la posición de corte. La muestra de tejido se puede elevar una longitud fija de X y luego moverla hacia un cuchillo afilado para cortar la capa delgada superior. Después del corte, la muestra se mueve nuevamente a la posición de imagen para que se pueda tomar la imagen de la cara del bloque. Todo el proceso de corte e imagen se repite hasta que desaparece toda la muestra. Tenga en cuenta que la señal fluorescente de una celda fluorescente en lo profundo de la muestra puede ser tenue en la cara del bloque (Fig. 2A). Sin embargo, a medida que la muestra se eleva, corta y toma imágenes repetidamente, la intensidad de la célula en la misma ubicación será cada vez más brillante en las imágenes de salida (Fig. 2C). La señal celular desaparecerá abruptamente cuando se corte una capa de tejido que contiene la célula (Fig. 2E). Por lo tanto, las señales de una sola célula se pueden observar en múltiples cortes, lo que da como resultado una fluorescencia subsuperficial.

Operación de corte e imagen en crioimagen. El diagrama ilustra cómo la crioimagen adquiere imágenes de caras de bloque. una muestra de tejido (cuadro verde), que contiene una célula fluorescente (círculo amarillo), se fija en una plataforma de corte (estructuras azules) que puede moverse hacia adelante y hacia atrás entre la posición de obtención de imágenes y la posición de corte. Después de que la cámara de arriba (A) toma la primera imagen de la cara del bloque, la muestra de tejido se eleva una longitud fija de X y luego se mueve hacia un cuchillo afilado para cortar la capa delgada superior (con el espesor de X). (B). Después del corte, la muestra se mueve nuevamente a la posición de imagen para que se pueda tomar la segunda imagen de la cara del bloque (C). Todo el proceso de corte e imagen se repite (D – E) hasta que desaparezca toda la muestra. Tenga en cuenta que este diagrama no está a escala.

Introducimos en el modelo un espesor de sección, X, que puede variar de 1 a 300 µm. (Como referencia, en muchos experimentos, hemos establecido X entre 20 y 40 µm para imágenes de animales pequeños). Al considerar las Ecs. (2)–(3), hay cuatro factores que contribuyen a la detectabilidad de la señal del fluoróforo: la señal del fluoróforo Ifluo (nivel de gris), la profundidad de la celda en relación con la superficie de la cara del bloque x (μm), el coeficiente de atenuación del tejido μT (cm-1) y el umbral de detección T (nivel de gris) (Fig. 1). Ahora considere el caso en que los fluoróforos están distribuidos uniformemente por todo el tejido comenzando desde la profundidad x = 0 (en el borde superior) hasta x = X (en el borde de la sección). Según la ecuación. (2), los fluoróforos que dan menor intensidad son los que residen en la parte inferior del corte o en la profundidad x = X. Por lo tanto, para poder detectar cada fluoróforo en el corte, la intensidad del fluoróforo en la profundidad x = X debe ser al menos el umbral de detección. Por tanto, la ecuación. (3) se convierte en:

En este estudio, definimos el espesor de corte óptimo Xóptimo (μm) como el espesor de corte más grande que garantiza que el sistema aún pueda detectar las señales más tenues de los fluoróforos que residen en el corte de tejido. A la profundidad x = Xóptima, los fluoróforos tienen una intensidad detectada igual al umbral de detección del sistema de imágenes Eq. (4). Al seccionar el tejido con un grosor superior a este valor, no se detectarán los fluoróforos en el borde inferior del corte. Al seccionar el tejido más delgado que este valor, aún se pueden detectar todos los fluoróforos, pero a expensas de deterioros mecánicos, mayor tiempo de obtención de imágenes y otros costos. Podemos determinar el espesor de corte óptimo reorganizando la ecuación. (4):

Curiosamente, el modelo también sugiere la intensidad fluorescente óptima Ioptimal (nivel de grises) que garantiza la perfecta detección de las señales fluorescentes en el caso de que el espesor del corte deba ser fijo. La intensidad fluorescente óptima es la intensidad mínima de las células fluorescentes que residen en la parte inferior del corte (x = X) que aún pueden ser detectadas por el sistema de imágenes. A esta intensidad o mayor, se garantiza la detección de todas las células fluorescentes en el corte de tejido. Si las células son más tenues que este valor, las señales fluorescentes en la parte inferior del corte se perderán. Con estas definiciones, la Ec. (4) se convierte en:

La Figura 3 ilustra la interacción del grosor del corte, la intensidad de la fluorescencia y el recuento de células. A partir de la ilustración, supongamos que N células fluorescentes están distribuidas uniformemente en un volumen de tejido homogéneo con una profundidad total de S µm. Cada célula está incrustada de forma que no se superponga a una profundidad de tejido fija con un intervalo de t µm donde t = S/N. Cada célula tiene una fluorescencia subsuperficial que puede extenderse a múltiples cortes superiores con una longitud de e µm. Durante la crioimagen, el volumen de tejido se secciona y se visualiza alternativamente, con un espesor de sección de X µm. El proceso se repite hasta que se acaba toda la muestra. Al final del proceso se producen aproximadamente imágenes fluorescentes S/X. Para contar el número de células en el volumen adquirido, se aplica el algoritmo de análisis de componentes conectados (CCA) para evitar el recuento múltiple de la misma célula debido a la fluorescencia del subsuelo.

Ilustración del efecto de diferentes espesores de sección sobre el número de recuentos de células. Este ejemplo supone 7 células no superpuestas (óvalos amarillos) que residen en cada intervalo de profundidad fijo de un volumen de tejido (cuadro verde). En este ejemplo, el intervalo de profundidad (t) es de 10 µm. Además, asumimos que la señal celular puede extenderse al corte superior, como la fluorescencia del subsuelo, como máximo 10 µm antes de que su señal se vuelva indetectable (gotas rojas). Por tanto, la profundidad fluorescente del subsuelo (e) es de 20 µm. Al seccionar este volumen a través de las señales de fluorescencia del subsuelo, las células correspondientes se marcan según se detectan en los cortes de la imagen de salida. Se pueden agrupar múltiples detecciones de la misma celda como una sola usando el algoritmo CCA. Por lo tanto, al seccionar el volumen con un espesor de sección (X) de 20 µm o menos, se pueden resolver todas las células dentro del tejido. Al seccionarlo con espesores de sección más grandes, como X = 30, 40 y 70 µm (arriba, derecha), se perderán las celdas, lo que resulta en una sensibilidad de detección reducida.

Al cortar y obtener imágenes a través del volumen, las señales celulares, así como las señales fluorescentes del subsuelo, se pueden usar para resolver la cantidad de células en el volumen. La Figura 3 ilustra la situación en la que S = 70 µm, N = 7 celdas, t = 10 µm y e = 20 µm. Con X = 20 µm, todas las células del tejido se pueden resolver y cuantificar correctamente. Aunque la distancia entre celdas adyacentes (t a 10 m) es menor que el grosor del corte (X a 20 m), la fluorescencia del subsuelo de la celda omitida aún puede aparecer en la imagen de salida. Suponiendo que las señales de las celdas adyacentes no se superponen a lo largo del eje z, siempre se puede resolver el número real de celdas. En el caso de sobremuestreo o uso de X <20 µm, las señales de la misma celda se pueden detectar varias veces, pero con la ayuda de CCA, el número de celdas se puede resolver correctamente. Pero en el rango de muestreo insuficiente o cuando X > 20 µm, el número de células detectadas será menor que el número real de células en el tejido, como se muestra en la Fig. 3. Esta situación conduce a falsos negativos. A continuación, propondremos un modelo matemático de la relación entre la detectabilidad de las células fluorescentes y el grosor del corte, especialmente en el rango subóptimo (X > Xóptimo).

En el rango subóptimo (X > Xóptimo), el número de células detectadas disminuye a medida que aumenta el grosor del corte. Al formular la relación matemática, se puede predecir la pérdida de células e incluso estimar un factor de corrección para compensar el submuestreo. En esta sección, pretendemos construir la relación bajo algunas simplificaciones.

Recuerde que las señales fluorescentes de la misma célula se pueden observar en múltiples cortes como una fluorescencia subsuperficial (Figs. 3 y 5). La fluorescencia fuera del plano produce una neblina subsuperficial en imágenes 2D y un artefacto de elongación a lo largo del eje z que aparece como una "cola de cometa" en 3D7,30,34. La longitud de la señal de una única célula fluorescente está gobernada por las Ecs. (2) y (3). Si el sistema de imágenes atraviesa cualquier parte de la fluorescencia del subsuelo, la señal celular debería aparecer en la imagen de salida. Por lo tanto, esta longitud fluorescente del subsuelo (e) es de hecho el espesor de corte óptimo (Xóptimo) como se ilustró anteriormente. Al considerar X > Xóptimo (lo que implica e/X < 1,0), el número de células observadas (n) se reduce del total de células en la muestra (N) de acuerdo con la distribución relativa, d(x), de las células que se encuentran en una rebanada dada. Por lo tanto, la distribución de las celdas también está relacionada con la probabilidad de que una celda esté a una distancia determinada, p(x). Esto se puede formular como

Tenga en cuenta que la distribución de probabilidad, p(x), para el espesor del corte X se determina a partir de la distribución dentro de cada uno de esos cortes, di(x). Si consideramos que podría haber distribuciones variables entre los sectores, entonces el p(x) promedio se determinaría como se muestra a continuación.

donde M es el número de cortes, i es el índice de corte, wi = Ni/N.

La sensibilidad de detección (Sens) viene dada por la relación n/N, que depende únicamente de la distribución de probabilidad de las células fluorescentes.

Suponiendo una función de densidad de probabilidad uniforme que correspondería a células distribuidas aleatoriamente en una gran región de tejido, la sensibilidad se puede formular de la siguiente manera:

Como tal, la sensibilidad es linealmente proporcional al recíproco de X y a la longitud de la fluorescencia del subsuelo (e):

Al tomar el logaritmo en ambos lados y reemplazar e con Xoptimal, se revela una relación lineal perfecta de -45º que se puede formar entre log(Sens) y log(X):

Recuerde que más allá del espesor de corte óptimo (X > Xóptimo), la sensibilidad de detección disminuye a medida que aumenta el espesor de corte. Además, recuerde que para todos los valores de X que sean menores o iguales a Xóptimo, el valor de Sens será 100%. Combinando valores de X tanto del rango ideal (X ≤ Xóptimo) como del rango subóptimo (X > Xóptimo), obtenemos:

Relaciones derivadas en la ecuación. (14) se puede utilizar para estimar las células fluorescentes que faltan en los datos de la imagen si se realiza una crioimagen con un espesor de corte mayor que el valor óptimo. Por definición de sensibilidad, el número real de células, Count(Xoptimal), se puede estimar dividiendo el número de células observadas en el volumen, Count(X), por la sensibilidad, Sens(X):

Para ello, la relación anterior se establece bajo los siguientes supuestos clave:

Todas las células están incrustadas en un tejido homogéneo: Varianza (μT) ≈ 0.

Las células del tejido tienen la misma intensidad: Varianza(Ifluo) ≈ 0.

Las células están bien distribuidas regionalmente en el tejido sin superposición.

En el caso de que exista alguna distribución, D(Ifluo), que pertenezca a las N células, entonces la sensibilidad general viene dada por:

lo cual, al considerar que las celdas tienen como máximo K valores de intensidad diferentes, se puede simplificar a una sumatoria discretizada

donde j es un índice correspondiente a la intensidad única Ifluo, j perteneciente a Nj células y K es el número de valores Ifluo únicos. Tenga en cuenta que Xoptimal no es negativo solo para valores de Ifluo ≥ T, pero Sens(Ifluo) = 0 para cualquier valor de Ifluo por debajo de T. En el caso de que las células tengan Ifluo < T, esas células no se detectarán independientemente del grosor del corte. y, por lo tanto, es necesario aumentar la intensidad de excitación I0 o mejorar otros componentes a lo largo de la cadena de imágenes de fluorescencia más allá de la consideración de este trabajo.

A continuación, mostraremos que las ecuaciones anteriores se ajustan a datos reales realizando experimentos in silico y comparando los resultados con datos reales. Más adelante, analizaremos experimentos in silico adicionales en situaciones en las que no se cumplen los supuestos clave.

Implementamos mediante programación simulaciones de seccionamiento digital para validar la relación en las Ecs. (13)–(14). Estos experimentos in silico se basaron en el modelo ilustrado en las Figs. 1, 2, 3 para validar la relación entre el grosor del corte y la sensibilidad de detección derivada anteriormente. El algoritmo de simulación de seccionamiento digital se resume a continuación: (1) Crear un volumen virtual homogéneo de la muestra completa (espesor = S μm) y un coeficiente de atenuación efectivo (μT, cm−1), (2) Distribuir las celdas del modelo cada 1 μm del volumen. Dado que hay una celda por cada 1 μm de profundidad, habrá N = S celdas en todo el volumen. Cada celda tiene una intensidad en escala de grises de Ifluo. (3) Para cada celda que reside en el volumen, medimos I(x) en la superficie de la cara del bloque, donde x es la profundidad de la celda en relación con la cara del bloque. El valor de I(x) está determinado por una ecuación gobernante en la ecuación. (2), (4) Si I(x) es mayor o igual que el umbral de detección, T, entonces la celda de prueba se marcará como detectada [Ec. (3)]. (5) Separe la capa superior del volumen en X μm, (6) Repita los pasos (3) a (5) hasta que todo el volumen de muestra se elimine por completo, (7) Genere el número de células detectadas. Los detalles del algoritmo se describen en el Pseudocódigo 1.

Con el algoritmo, realizamos dos experimentos in silico con valores de parámetros en el rango típicamente observado en aplicaciones de crioimagen. Para el primer experimento, variamos el espesor de la sección y medimos la sensibilidad correspondiente: Sens = n/N = TP/(TP + FN) donde TP, FP y FN son verdaderos positivos, falsos positivos y falsos negativos, respectivamente. Esperamos que seccionar la muestra con un espesor mayor que el espesor de sección óptimo (X> Xóptimo) afecte negativamente a la sensibilidad. Se eligieron tres intensidades de celda para esta simulación: Ifluo = 30, 50 y 80 (intensidad en escala de grises). Los números se eligieron a partir de la distribución de intensidad de las células derivadas de nuestra base de datos de imágenes de células madre. Los parámetros T y μT se establecieron en 10 (nivel de grises) y 314 cm-1, respectivamente. El valor del umbral de detección (T) se estimó empíricamente en función de la relación señal-ruido (SNR) en nuestros datos de imagen. El valor de μT se estimó a partir de tejidos de ratón en nuestra base de datos utilizando un método de ajuste exponencial propuesto por Steyer et al.34. La plataforma de programación utilizada en este estudio fue Matlab 2022a (MathWorks, EE. UU.).

En el segundo experimento, fijamos el grosor del corte pero variamos la intensidad celular y medimos la sensibilidad correspondiente. Al fijar el grosor del corte (X = 20 μm), esperamos que las células con una intensidad por debajo de la intensidad óptima (Ifluo

Para probar aún más la validez de nuestro modelo, comparamos los resultados simulados con datos reales. Realizamos la operación de sección e imagen en los datos reales para generar secciones más gruesas. Estas nuevas secciones se tomaron de imágenes reales en rodajas finas que contenían células fluorescentes. En este estudio utilizamos dos conjuntos de datos: (1) células madre marcadas con fluorescencia en un modelo de ratón2,9,11,12 y (2) microesferas fluorescentes en un modelo de cerdo5,26. Los detalles sobre los experimentos con animales se describen en el Documento complementario. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Case Western Reserve. También confirmamos que el estudio se informa de acuerdo con las pautas de ARRIVE. A continuación, describimos los pasos para simular secciones gruesas tomadas de datos reales finamente cortados para determinar el efecto del grosor del corte en la sensibilidad de detección. Nuestra hipótesis es que los resultados predichos por la teoría [Ecs. (13)–(14)] deben correlacionarse con datos reales.

En el primer conjunto de datos, utilizamos el conjunto de datos de células madre para la simulación. En Supl. se muestra una imagen sin procesar que se acerca a las señales de las células fluorescentes. Figura 1A. Luego, las imágenes se apilaron, registraron y visualizaron en 3D en la Fig. 4B. Para realizar simulaciones de secciones e imágenes, creamos un nuevo volumen de datos de cortes más gruesos eligiendo imágenes del volumen original pero omitiendo cada 2 cortes. Dado que el espesor de la sección se estableció originalmente en 20 μm, el nuevo volumen, que constaba de la mitad de las imágenes originales, tendría un espesor de corte de 40 μm. Para obtener volúmenes de diferentes espesores de corte, repetimos el experimento omitiendo cada 3, 4, 5... 50 cortes para parecerse a una crioimagen con un espesor de corte de 60, 80, 100,... 300 μm, respectivamente. Para cada volumen, se detectó y cuantificó el número de células madre mediante el algoritmo publicado anteriormente, que incluye 3D CCA10. Resumimos el proceso en el Pseudocódigo 2. Para comparar los resultados con nuestro modelo, ejecutamos una simulación in silico (Pseudocódigo 1) con parámetros estimados a partir de datos reales. Brevemente, se estimó utilizando la intensidad media de las células detectadas. T se estimó heurísticamente optimizando el número de detecciones de células mientras se minimizaban los falsos positivos, y finalmente se estimó μT utilizando un método de regresión exponencial propuesto por Steyer et al.34. Para probar la validez de la simulación, realizamos una prueba de correlación de los resultados de la simulación con los resultados de datos reales. Empleamos el coeficiente de correlación momento-producto de Pearson y el error cuadrático medio (error RMS) como métricas.

La crioimagen permitió la visualización y cuantificación de células madre en cualquier lugar de ratones con una tasa de recuperación muy alta. A un ratón se le inyectaron por vía intravenosa 5 × 105 células madre. Se detectaron y visualizaron aproximadamente 290.000 células (perlas amarillas en A). La tasa de recuperación (número de células detectadas/entrega) fue del 58 %. En otro experimento, se inyectaron directamente 1 × 105 células madre en el lóbulo pulmonar de un ratón. Se detectaron aproximadamente 94.269 células (perlas magenta en B). Esto arrojó una tasa de recuperación del 94%.

En el segundo conjunto de datos, utilizamos imágenes de un corazón de cerdo, que contenían microesferas fluorescentes, para realizar la simulación. Se inyectaron microesferas rojas y verdes en el ventrículo derecho del cerdo en diferentes condiciones fisiológicas (ver Documento complementario). Como el corazón de cerdo era bastante grande, utilizamos sólo una pequeña porción del tejido. El espesor de la sección se fijó en 10 µm. Debido a que las microesferas rojas y las microesferas verdes tenían un brillo diferente bajo nuestro filtro de imágenes estándar1,2,5,9, las procesamos por separado. Las microesferas rojas eran de una intensidad mucho más brillante que las microesferas verdes. En Suppl. se muestran ejemplos de señales de microesferas fluorescentes y visualización 3D. Fig. 1B y Fig. 5, respectivamente. Realizamos la simulación de sección e imagen para crear nuevos volúmenes utilizando el mismo proceso que se aplicó a los datos de células madre. Los parámetros Ifluo, T y μT para las microesferas también se estimaron utilizando el mismo método descrito anteriormente. Nuevamente, los resultados in silico se compararon con datos reales.

Microesferas rojas y verdes en los datos de crioimagen del miocardio porcino. Se inyectaron microesferas rojas en el ventrículo izquierdo de un cerdo durante una condición inicial, mientras que se inyectaron microesferas verdes en el mismo sitio durante la isquemia inducida. Las figuras (A) (alejar) y (B) (alejar) muestran representaciones de volumen de las microesferas atrapadas en el tejido del miocardio desde un segmento del vértice del corazón. Las señales fluorescentes tenían colores falsos según los espectros de emisión de microesferas (rojo y verde). Observe que las microesferas rojas eran más brillantes que las microesferas verdes bajo nuestro sistema de imágenes. La Figura (C) muestra la fluorescencia subsuperficial de una microesfera roja que se extendía varios cortes por encima del corte que contiene la microesfera (corte 15). Una vez seccionado el corte, la señal desapareció (corte 16). En este ejemplo, la intensidad en los cortes más allá del "corte 10" estaba por debajo del umbral de detectabilidad. El espesor del corte fue de 10 µm.

Para mostrar los efectos de los incumplimientos en los supuestos clave para la detectabilidad, realizamos 3 simulaciones in silico adicionales. Las simulaciones tienen como objetivo estudiar los efectos de (1) la falta de homogeneidad del tejido, (2) las variaciones del brillo de las células y (3) la superposición de la señal celular en la detectabilidad como se observa en las curvas de sensibilidad-espesor. En la primera simulación, las células modelo se colocaron en un tejido virtual sin superponerse. Todas las células tenían el mismo brillo (Ifluo = 40) pero experimentaron diferentes atenuaciones de tejido µT para simular situaciones en las que el tejido de interés es una mezcla de diferentes tipos de tejido (tejido no homogéneo). Se probaron cuatro niveles de variabilidad: (1) µT = 314 cm−1 (sin variación), (2) µT = 314 ± N(σ ~ 50) cm−1, (3) µT = 314 ± N(σ ~ 100 ) cm−1, y (4) µT = 314 ± N(σ ~ 150) cm−1, donde N(σ) representa un generador de números aleatorios normal con media cero y una desviación estándar de σ. El corte digital se realizó para medir la sensibilidad versus el espesor del corte según el Pseudocódigo 1.

En la segunda simulación, las células modelo se colocaron en un tejido virtual homogéneo pero con variaciones en el brillo celular. Se probaron cuatro niveles de variabilidad: (1) Ifluo = 40 (sin variación), (2) Ifluo = 40 ± N(σ ~ 5) cm−1, (3) Ifluo = 40 ± N(σ ~ 10) cm− 1, y (4) Ifluo = 40 ± N(σ ~ 15) cm−1. El coeficiente de atenuación tisular efectivo µT se fijó en 314 cm-1. La variabilidad puede representar situaciones tales como células que pierden tintes fluorescentes, células muertas, células en división, fotoblanqueo, etiquetado deficiente, etc. Luego, realizamos el corte digital en estas simulaciones para medir la curva de sensibilidad-espesor como se describe en el Pseudocódigo 1.

En la última simulación, simulamos el efecto de diferentes grados de superposición de células en la detectabilidad. La superposición de células se define como dos células diferentes que residen muy cerca una de otra a lo largo del eje de profundidad, de modo que sus señales fluorescentes subsuperficiales pueden fusionarse y "verse" como una señal única. Esto puede causar una disminución en la sensibilidad de detección ya que dos o más células solo se cuentan como una. Para mostrar el efecto, la simulación se realizó colocando aleatoriamente las células modelo en un área de tejido fija para permitir que se superpongan las fluorescencias del subsuelo de múltiples células. El grado de superposición se rige por la densidad, que se calcula mediante el número de células del modelo por área de tejido (en unidades de células/cm2). Se probaron cuatro grados de superposición de células: (1) Sin superposición, (2) Densidad = 400 células/cm2, (3) Densidad = 800 células/cm2 y (4) Densidad = 1600 células/cm2. Los valores de µT e Ifluo se fijaron en 314 cm−1 y 40, respectivamente. Los diferentes grados de superposición de células representan casos como agregación de células inmunes en los tejidos linfoides/inflamados, masas tumorales, embolias pulmonares, etc. Nuevamente, se midió e informó la curva de sensibilidad-espesor.

La crioimagen permitió la visualización en 3D y la cuantificación de células marcadas con fluorescencia en un ratón con una tasa de recuperación muy alta. Como se describe en el documento complementario, al ratón se le inyectaron por vía intravenosa 5 × 105 MAPC. Después de ejecutar el algoritmo de detección de células madre10, se detectaron y visualizaron aproximadamente 290.000 células (perlas amarillas en la Fig. 4A). En este conjunto de datos, la tasa de recuperación (número de células detectadas/entrega) fue del 58 %. En otro experimento, se inyectaron directamente 1 × 105 MSC clasificadas por FAC en el lóbulo pulmonar de un ratón. Después de aplicar el algoritmo, se detectaron 94.269 células (perlas magenta en la Fig. 4B). Esto produce una tasa de recuperación del 94%. El número de detecciones en ratones inyectados con células no marcadas (falsos positivos) fue significativamente pequeño (p <0,01, prueba t de Student de dos colas). En Supl. se muestran ejemplos de señales de células madre. Figura 1A.

Las simulaciones in silico revelaron las relaciones entre el grosor del corte y la sensibilidad de detección. Realizamos dos simulaciones: en la primera, realizamos un corte digital con diferentes espesores de corte y medimos la sensibilidad de detección correspondiente. El espesor del corte (X) osciló entre 5 y 150 µm. Observamos que con valores pequeños de espesor de corte, la sensibilidad se mantuvo al 100% hasta que el valor alcanzó un cierto punto en el que la sensibilidad comenzó a disminuir (Fig. 6). De hecho, este punto fue el grosor de corte óptimo (Xóptimo) para la crioimagen. En esta simulación, examinamos tres valores de intensidad: Ifluo = 30, 50 y 80 (nivel de gris). Los parámetros T y μT se establecieron en 10 (nivel de grises) y 314 cm-1, respectivamente. Ilustramos las simulaciones en la Fig. 7 para mostrar cómo aparecen las señales de las células modelo y su detectabilidad en el volumen virtual. Tenga en cuenta que las células se colocaron en el tejido de acuerdo con la suposición de que no se superponen. Como resultado, encontramos que Xoptimal para Ifluo = 30, 50 y 80 simulaciones fueron 35 μm, 51 μm y 66 μm, respectivamente. Los resultados fueron consistentes con el espesor de sección óptimo estimado por la Ec. (5). Observamos que para niveles de intensidad fluorescente más bajos (Ifluo), la sensibilidad disminuyó a un ritmo mayor (diferentes marcadores en la Fig. 6A). En el rango subóptimo (X > Xóptimo), la curva apareció como la función recíproca derivada en la ecuación. (14). Al mostrar la relación en una escala log-log, se muestra que la relación es perfectamente lineal (Fig. 6B), como lo predice la derivación matemática descrita en la Sección "Simulaciones in silico para situaciones de incumplimiento".

La relación entre el espesor de la sección y la sensibilidad de detección estimada por la simulación fue consistente con la teoría. El resultado de la simulación en (A) revela el espesor de corte óptimo (Xóptimo), que es el espesor de corte más grande que produce una sensibilidad de detección del 100 %. Al seccionar el volumen con un espesor de sección mayor que este valor (hacia la derecha del gráfico), la sensibilidad disminuyó significativamente. En esta simulación, simulamos 3 niveles de intensidad celular: Ifluo = 30, 50 y 80 (nivel de gris). Observamos que cuanto más brillantes eran las células fluorescentes, mayor era el valor del grosor del corte. Esto fue consistente con nuestra derivación en la Ec. (14). Curiosamente, cuando trazamos la relación en una escala log-log (B), el gráfico mostró una linealidad perfecta en el rango subóptimo (X > Xóptimo).

Ilustración del efecto de diferentes intensidades celulares sobre la detectabilidad. Simulamos situaciones con 3 intensidades de celda: Ifluo = 30 en (A), 50 en (B) y 80 en (C). En las simulaciones, colocamos células sintéticas de forma que no se superpongan en un volumen virtual. Cada célula extendió su fluorescencia subsuperficial hacia arriba según lo gobernado por la ecuación. (2). La visualización de la detectabilidad de las células en (A – C) se mostró en (D – F), respectivamente. Estos se realizaron binarizando las señales celulares en (A – C) usando la ecuación. (3). Los resultados muestran que la detectabilidad celular (la longitud de fluorescencia subsuperficial) es linealmente proporcional a la intensidad celular.

Para la segunda simulación, estudiamos el efecto de los niveles de intensidad celular en la sensibilidad de detección (Fig. 8). En esta simulación, fijamos el espesor de la sección (X = 20 μm) pero variamos la intensidad de la celda entre 1 y 30 (nivel de gris). También repetimos la simulación con diferentes coeficientes de atenuación del tejido (μT), que fueron 214, 314 y 414 cm-1 (en pasos de 100 cm-1). El resultado en la Fig. 8 muestra que la sensibilidad podría mantenerse al 100% cuando la intensidad celular fuera mayor que la intensidad óptima como se predice en la ecuación. (6). Encontramos que para μT = 214, 314 y 414 (cm-1), los valores estimados de Ióptimo fueron 15,34, 18,74 y 22,89 (nivel de grises), respectivamente. El resultado muestra que cuanto mayores eran los valores de μT, mayor era el brillo celular requerido para mantener el 100% de sensibilidad. Como se esperaba, las células con una intensidad por debajo del umbral de detectabilidad (T = 10) dieron como resultado una pérdida del 100% (0% de sensibilidad). También ilustramos las simulaciones en la Fig. 9 para mostrar cómo aparecen las señales de las células modelo y su detectabilidad en el volumen virtual. Los resultados muestran que la detectabilidad celular (la longitud de fluorescencia subsuperficial) está inversamente correlacionada con el coeficiente de atenuación del tejido como se describe en la ecuación. (5).

La relación entre la intensidad celular y la sensibilidad de detección estimada por la simulación también fue consistente con la teoría. En esta simulación in silico, se registró la sensibilidad de detección para cada cambio en el brillo de la celda. El resultado sugiere que para mantener una sensibilidad de detección del 100%, la intensidad celular debe ser al menos la intensidad celular óptima como se predice en la ecuación. (6). Por otro lado, con una intensidad menor que este valor (hacia la izquierda del eje x), la sensibilidad disminuyó significativamente. Al aumentar el coeficiente de atenuación del tejido (μT), se necesitaría una mayor intensidad celular para mantener una sensibilidad de detección del 100% (diferentes marcadores).

Ilustración del efecto de diferentes coeficientes de atenuación tisular sobre la detectabilidad. Simulamos situaciones con 3 coeficientes de atenuación del tejido: µT = 214 cm-1 en (A), 314 cm-1 en (B) y 414 cm-1 en (C). La visualización de la detectabilidad de las células en (A – C) se mostró en (D – F), respectivamente. Los resultados muestran que la detectabilidad celular (la longitud de fluorescencia subsuperficial) está inversamente correlacionada con el coeficiente de atenuación del tejido como se describe en la ecuación. (5).

A continuación analizamos la correlación entre nuestras simulaciones y los datos reales. Para los datos del tejido miocárdico porcino, encontramos alrededor de 4600 microesferas fluorescentes (rojas y verdes) en el volumen de interés (Fig. 5). Realizamos simulación de secciones e imágenes con diferentes espesores de corte que van desde 10 a 300 μm. Después de realizar la cuantificación de microesferas, el número de microesferas rojas y verdes se muestra en las Fig. 10A y B, respectivamente. Como era de esperar, con valores pequeños de espesor de corte (hacia la izquierda del gráfico), todas las microesferas en el volumen de tejido se pudieron resolver correctamente. Al aumentar el valor del grosor del corte (hacia la derecha del gráfico), la sensibilidad solo podría mantenerse al 100% hasta que el valor alcanzara un cierto punto (Xóptimo) en el que los falsos negativos comienzan a aumentar. Esta observación fue válida tanto en conjuntos de datos de microesferas rojas como verdes. Realizamos simulaciones in silico de forma independiente creando las relaciones basadas en parámetros estimados. Se encontró que los conjuntos de parámetros eran (Ifluo = 300, μT = 332 cm-1) para la simulación de microesferas rojas y (Ifluo = 87, μT = 372 cm-1) para la simulación de microesferas verdes, respectivamente. Los resultados de la Fig. 10 muestran que la relación entre el espesor del corte y la detectabilidad de la simulación casi coincidía con los datos reales. Los coeficientes de correlación entre las dos relaciones fueron 0,998 y 0,999 para las microesferas roja y verde, respectivamente. Después de detectar y cuantificar las microesferas, el conjunto de datos contenía alrededor de 2.000 microesferas rojas y 2.600 microesferas verdes. Los errores RMS medidos fueron 36,54 (1,82%) y 42,87 (1,65%) para las microesferas roja y verde, respectivamente. Los resultados también muestran que los valores estimados de Xoptimal fueron 102,45 μm para las microesferas rojas y 58,15 μm para las microesferas verdes. Estos valores indican el mejor espesor de sección que garantiza la detección ideal de microesferas con el mínimo número de cortes. Observamos que las microesferas rojas eran aproximadamente 3 veces más brillantes que las microesferas verdes en los datos sin procesar (Supl. Figs. 1B y Fig. 5). Como resultado, las microesferas rojas permitieron un mayor espesor de corte en comparación con las microesferas verdes (Fig. 10A, B). Esto fue consistente con nuestra derivación en la Ec. (5). Nuevamente, al trazar las relaciones en una escala log-log, los resultados muestran relaciones lineales casi perfectas en el rango subóptimo (X > Xóptimo) (Fig. 10C,D).

La relación entre la detectabilidad de las microesferas y el grosor del corte obtenida a partir de datos reales estuvo altamente correlacionada con la de las simulaciones. En este experimento, el volumen de tejido que contenía aproximadamente 4600 microesferas fluorescentes se seccionó con diferentes espesores de corte (de 10 a 300 µm). Se muestra el número de detecciones de microesferas para cada espesor de corte (línea negra con marcadores triangulares) para las microesferas rojas en (A) y para las microesferas verdes en (B). Con parámetros cuidadosamente elegidos, nuestra simulación pudo predecir las relaciones que coincidían completamente con los datos reales (línea gris con marcadores cuadrados). Curiosamente, cuando trazamos las relaciones en una escala log-log (C-D), los resultados muestran la relación lineal perfecta entre el número de detecciones y el grosor del corte. Esto podría usarse para estimar el número real de celdas en los datos, especialmente cuando el grosor del corte elegido es mayor que el óptimo.

La relación obtenida del conjunto de datos de células madre también fue consistente con la simulación. En este conjunto de datos, se inyectaron directamente aproximadamente 1 × 105 células madre marcadas con fluorescencia en un lóbulo del pulmón de un ratón. Se realizaron repetidamente secciones e imágenes simuladas y detección de células en el volumen de tejido con diferentes espesores de corte que oscilaban entre 10 y 300 μm. Los resultados de la Fig. 11 muestran que la relación "detección de células versus grosor del corte" era consistente con la teoría. La relación obtenida de la simulación también coincidía bien con los datos reales. El coeficiente de correlación fue de 0,999 y el error RMS fue de 1601 células (o 1,6% de las células inyectadas). Los resultados de la Fig. 11 sugieren que el Xóptimo era de alrededor de 40 µm, mientras que el modelo predijo que el Xóptimo era de 42,52 µm. Los parámetros estimados fueron T = 10, Ifluo = 38 y μT = 314 cm-1 para las células madre marcadas con puntos cuánticos rojos. Observamos que el rango de valores Xóptimos para las células era mucho más estrecho que el de las microesferas fluorescentes (~ 40 μm frente a ~ 60–100 μm). Esto se debió a que el brillo de las células (~ 40) era mucho menor que el de las microesferas (~ 80–400).

La relación entre la detectabilidad celular y el grosor del corte obtenida a partir de datos reales también estuvo altamente correlacionada con la de las simulaciones. En este experimento, se inyectó a un pulmón de ratón 1 × 105 células madre marcadas con fluorescencia. El volumen de tejido se seccionó con diferentes espesores de corte (de 20 a 300 µm). Se informan los números de detección de células para cada espesor de corte (A). La relación en una escala log-log también se muestra en (B). Nuevamente, la simulación pudo predecir la relación ya que casi se superponía (línea gris con marcadores cuadrados) con los datos reales (línea negra con marcadores triangulares). El coeficiente de correlación entre datos reales y simulados fue de 0,999. El valor Xóptimo fue de alrededor de 40 µm, donde el modelo predijo que el valor Xóptimo sería 42,52 µm.

Además, realizamos tres experimentos in silico para mostrar los efectos de suposiciones clave sobre la detectabilidad. En primer lugar, se probó el efecto de la falta de homogeneidad del tejido asignando a las células modelo diferentes valores de µT para simular situaciones en las que el tejido de interés es una mezcla de diferentes tipos de tejido. La Figura 12 ilustra las señales celulares y sus señales detectables en tres tejidos virtuales, cada uno con diferentes niveles de variabilidad µT. Tenga en cuenta que la intensidad celular y su detectabilidad en todos los resultados se rigen por las Ecs. (2) y (3), respectivamente. Las curvas de sensibilidad-espesor correspondientes se muestran en la Fig. 13. En comparación con el tejido homogéneo, la sensibilidad en el tejido no homogéneo disminuyó antes del punto óptimo. Los puntos óptimos en estas situaciones no están bien definidos y son difíciles de determinar en la curva sensibilidad-espesor. También observamos que cuanto mayor es la variación, menos pronunciada es la pendiente sensibilidad-espesor (inclinada hacia 0°) en la escala log-log (Fig. 13B).

Ilustración del efecto de la falta de homogeneidad del tejido en la detectabilidad. Los µT en las simulaciones (A – C) se establecieron en 314 ± N(σ ~ 50) cm-1, 314 ± N(σ ~ 100) cm-1, 314 ± N(σ ~ 150) cm-1, respectivamente. N(σ) representa un generador de números aleatorios normal con media cero y una desviación estándar de σ. La visualización de la detectabilidad de las células en (A – C) se mostró en (D – F), respectivamente. El valor más alto de σ refleja el mayor nivel de falta de homogeneidad en el coeficiente de atenuación del tejido.

El efecto de la falta de homogeneidad del tejido en la sensibilidad de detección. Sin variación, como en un tejido homogéneo [línea negra en (A)], la sensibilidad de detección comienza a disminuir exactamente en el punto de espesor de corte óptimo. Con variaciones como en tejidos no homogéneos, la sensibilidad disminuyó mucho antes del punto óptimo. Cuanto mayor es la variación, menos pronunciada es la pendiente sensibilidad-espesor (inclinada hacia 0°) en la escala log-log (B).

En segundo lugar, el efecto de variación del brillo de las celdas se probó asignando a las celdas del modelo diferentes valores de Ifluo. La Figura 14 ilustra las señales celulares y sus señales detectables en tres tejidos virtuales, cada uno con diferentes niveles de variabilidad Ifluo. Las curvas de sensibilidad-espesor correspondientes se muestran en la Fig. 15. En comparación con el caso de brillo celular estable, la sensibilidad disminuyó mucho antes que el punto óptimo. Nuevamente, los puntos óptimos no están bien definidos y son difíciles de determinar en la curva sensibilidad-espesor. Además, observamos que todas las curvas de sensibilidad-espesor mantuvieron la misma pendiente a -45 ° en la escala log-log (Fig. 15B).

Ilustración del efecto de las variaciones de brillo de la celda sobre la detectabilidad. Los Ifluo en las simulaciones (A – C) se establecieron en 40 ± N (σ ~ 5), 40 ± N (σ ~ 10), 40 ± N (σ ~ 15), respectivamente. N(σ) representa un generador de números aleatorios normal con media cero y una desviación estándar de σ. El valor más alto de σ refleja el mayor nivel de falta de homogeneidad en el brillo de la celda. La visualización de la detectabilidad de las células en (A – C) se mostró en (D – F), respectivamente.

El efecto de las variaciones del brillo de las células sobre la sensibilidad de detección. Sin variación en la intensidad celular (línea negra en (A)), la sensibilidad de detección comienza a disminuir exactamente en el punto de espesor de corte óptimo. Con las variaciones, la sensibilidad disminuyó mucho antes del punto óptimo. Los puntos óptimos en estas situaciones no están bien definidos y son difíciles de determinar en la curva sensibilidad-espesor. También observamos que todas las curvas de sensibilidad-espesor mantuvieron la misma pendiente a -45 ° en la escala log-log (B).

Por último, se probó el efecto de superposición de células colocando aleatoriamente las células modelo dentro de un área fija del tejido virtual para permitir superposiciones de su fluorescencia subsuperficial. El grado de superposición se rige por la densidad, que se calcula mediante el número de células modelo por área de tejido. La Figura 16 ilustra las señales celulares y sus señales detectables en tres tejidos virtuales, cada uno con diferentes valores de Densidad. Denotamos algunos de los puntos superpuestos en la Fig. 16 usando puntas de flecha amarillas. Las curvas de sensibilidad-espesor correspondientes se muestran en la Fig. 17. En comparación con el caso sin superposición, las curvas de sensibilidad en los casos superpuestos disminuyeron linealmente desde el principio (X = 1 µm) hasta alcanzar el punto óptimo (en X = 44 µm). µm) donde las curvas comenzaron a disminuir hiperbólicamente. Curiosamente, los puntos óptimos estaban bien definidos en todas las situaciones (X = 44 µm), pero las sensibilidades ya no podían garantizar el 100% en ningún punto (excepto X = 1 µm). Con mayores grados de superposición de células (según lo determinado por la densidad), la curva de sensibilidad disminuyó a un ritmo mayor.

Ilustración del efecto de la superposición de células en la detectabilidad. Dos celdas cualesquiera pueden superponerse si están demasiado cerradas a lo largo del eje vertical de modo que sean "vistas" como un solo objeto (puntas de flecha amarillas). El efecto de superposición siempre da como resultado falsos negativos o falta de células. También experimentamos con diferentes densidades celulares para exagerar los efectos de superposición de células. En las simulaciones (A – C), las densidades celulares se establecieron en 400, 800, 1600 células/cm2, respectivamente. La visualización de la detectabilidad de las células en (A – C) se mostró en (D – F), respectivamente.

El efecto de la superposición de celdas en la sensibilidad de detección. Sin superposición de las señales de las células (línea negra), la sensibilidad de detección comienza a disminuir exactamente en el punto de espesor de corte óptimo. Con la superposición, la sensibilidad disminuyó linealmente desde el principio (X = 1 µm) hasta alcanzar el espesor de corte óptimo (X = 44 µm) donde la sensibilidad comenzó a disminuir hiperbólicamente. Con un mayor grado de superposición de células (según lo determinado por la densidad), la sensibilidad disminuyó a un ritmo mayor. Aunque los puntos óptimos están bien definidos en todas las situaciones (a X = 44 µm), no se pudo mantener la sensibilidad perfecta en todas las situaciones (Sens < 100%).

Creamos un modelo adecuado para guiar la selección del grosor del corte en sistemas de sección e imagen para aplicaciones de detección de células (p. ej., células madre y micrometástasis) y microesferas. El modelo describe explícitamente los factores que contribuyeron a la detectabilidad de las células fluorescentes en crioimagen por primera vez. Los factores clave fueron el grosor de la sección (X), la intensidad de las células fluorescentes (Ifluo), el coeficiente de atenuación efectiva del tejido (μT) y el umbral de detección del sistema (T). El modelo sugiere el valor del espesor de corte óptimo [Xóptimo en la ecuación. (5)] que es el espesor de corte más grande que garantiza el 100% de detección de células. Este espesor de corte óptimo no solo permite que el sistema de crioimagen adquiera y detecte todas las células fluorescentes en la muestra de tejido, sino que también permite a los usuarios acelerar el proceso de obtención de imágenes y extender la vida útil de la cuchilla de corte y otras piezas mecánicas. . El modelo se construyó a partir de datos derivados de la técnica de crioimagen bajo algunos supuestos clave. Especulamos que el modelo podría ser aplicable a otras técnicas de imágenes de caras de bloques, como la microscopía electrónica de barrido de caras de bloques en serie (SBEM), la microscopía con imágenes de excitación de superficie UV (MUSE), etc.

En este trabajo, presentamos por primera vez la relación entre el grosor del corte (X) y la sensibilidad de detección (Sens). Esta relación se estableció bajo los supuestos clave que establecen que todas las células de intensidad estable se distribuyeron uniformemente sin superposición en un tejido homogéneo. Con estos supuestos, podríamos derivar modelos matemáticos que predigan el número de detecciones de células Ec. (11) y los valores Sens de las Ecs. (13)–(14) para cada elección subóptima del grosor del corte (X > Xóptimo). Después de ejecutar simulaciones in silico basadas en los supuestos, hicimos las siguientes observaciones. Cuando X ≤ Xóptimo, el valor Sens fue constante al 100%, pero cuando X > Xóptimo, disminuyó como una función no lineal de X (Fig. 6A). Se demostró que la relación en el rango subóptimo es una función recíproca de X Eq. (14). Cuando se representó en una escala log-log, la relación fue lineal con una pendiente de -1 (Fig. 6B). Especulamos que esta relación sería válida para datos reales si las células fluorescentes se comportaran de una manera consistente con nuestras suposiciones clave. Tenga en cuenta que también desarrollamos un modelo probabilístico para predecir el perfil de sensibilidad en los casos en que la distribución celular no es uniforme. (7) – (10) y con intensidad variable Ecs. (16)–(17).

Proponemos que la relación podría usarse para estimar el número real de celdas cuando se elige un grosor de corte demasiado grande (X > Xóptimo). En muchas aplicaciones, es necesario que los usuarios de crioimagen elijan un grosor de corte mayor para analizar una gran porción de tejido, como corazones de cerdo5,22,23,27, corazones de perro7,21 o tejidos de conejo24. Como el volumen de muestra es prohibitivamente grande, se debe seleccionar un espesor de corte mucho mayor para optimizar de manera eficiente el tiempo de obtención de imágenes, el espacio de memoria y otros costos. Sin embargo, cuanto mayor era el grosor del corte más allá del valor Xóptimo, mayor era el número de falsos negativos. Para mitigar este problema, proponemos que la relación derivada en las Ecs. (14)-(15) se pueden utilizar para estimar el número real de células/microesferas. Por ejemplo, si los investigadores realizaron un estudio de biodistribución de microesferas en un animal grande y necesitaron establecer un grosor de corte grande, digamos X = 100 μm mientras que Xóptimo = 58 μm. Al hacerlo, las señales celulares adquiridas en sus datos de imagen podrían obtenerse con una sensibilidad de solo el 58% (42% perdido), como lo sugieren las Ecs. (14)–(15). Para corregir esto, se puede considerar multiplicar el número de microesferas encontradas por un factor de 1/Sens (1/0,58 en nuestro ejemplo) para estimar el número real de microesferas fluorescentes en el tejido. Este conocimiento permite a los operadores de crioimagen utilizar cortes de mayor espesor (mucho más grandes que Xoptimal) sin una pérdida significativa de las microesferas. Estas correcciones podrían permitir reducir el tiempo de exploración de un tejido grande, como el corazón de un cerdo, pasando de días o semanas a horas o días. Este hallazgo hace factibles análisis que antes no eran de otra manera.

Validamos con éxito el modelo utilizando datos reales de dos estudios independientes. El modelo describe bien las observaciones de los datos reales. El primer conjunto de datos procedía de un experimento que estudiaba células madre marcadas con fluorescencia en un modelo de ratón2,9,11,12. El segundo conjunto de datos procedía de otro experimento que estudiaba la biodistribución de microesferas fluorescentes en un corazón de cerdo5,26. Al realizar una simulación de sección e imagen en estos conjuntos de datos, se encontró que el grosor del corte medido y las relaciones de detección de células estaban bien correlacionadas con los de los resultados de la simulación in silico (Figs. 10 y 11). Las correlaciones entre las curvas fueron superiores al 99%. Creemos que este alto grado de coincidencia se debió en gran medida al hecho de que la distribución de microesferas / células fluorescentes en los conjuntos de datos se ajustaba a nuestras suposiciones (Figs. 4B y 5). Actualmente, estamos trabajando en casos en los que la distribución de células en la muestra no es consistente con los supuestos debido a superposición o intensidad variada. Ejemplos de estos son embolias pulmonares en un tejido pulmonar después de la inyección intravenosa de las células (Fig. 4A), una masa tumoral o metástasis en un modelo de ratón4,13,14,15,16,17,18,19, una agregación de células activadas células inmunes en órganos linfoides secundarios3,9,11,12, etc.

Al tener una intensidad fluorescente más brillante, el grosor del corte podría establecerse en un valor mayor. Según el protocolo actual de crioimagen1,5,9,10, los conjuntos de datos muestran que los valores de intensidad fluorescente (Ifluo) de las microesferas rojas, las microesferas verdes y las células madre marcadas con puntos cuánticos fueron aproximadamente 300, 87 y 38, respectivamente. Los espesores de corte óptimos estimados para estas microesferas y células fluorescentes fueron 102, 58 y 43 μm, respectivamente. Si se debe fijar el grosor del corte, se debe mantener un alto brillo de la celda para garantizar la presencia de la señal en las imágenes de salida. Nuestro modelo sugiere que la intensidad de la celda no debe ser inferior al brillo mínimo de la celda Ióptimo como se describe en la ecuación. (6). Dado que las células marcadas con fluorescencia eran mucho más tenues que las microesferas fluorescentes, los investigadores deben asegurarse de que las células estén marcadas con fluorescencia con una intensidad mayor que el valor recomendado. Esto podría hacerse por varios medios. Un ejemplo es seleccionar solo las células brillantes a través de la máquina de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) antes de la entrega in vivo. Se debe considerar que la división celular, la muerte celular, el fotoblanqueo de los fluoróforos y otros factores podrían contribuir a la variación del brillo celular. Si se espera una pérdida rápida del brillo de la celda, se podría utilizar un grosor de corte más pequeño para compensarla. Otro método para aumentar el brillo de la celda es aumentar el tiempo de exposición de la cámara. Debido a la alta relación señal-ruido de los fluoróforos, un tiempo de exposición más prolongado suele aumentar el contraste de las células de interés. Nuevamente, las celdas más brillantes permiten a los operadores usar cortes de mayor espesor como se describe en la ecuación. (5). Sin embargo, al aumentar el tiempo de exposición, el tiempo total de exploración será más prolongado. Para escanear un corazón de cerdo (espesor de muestra de 10 cm con espesor de corte de 20 µm, 5 × 5 mosaicos por corte), puede llevar hasta 3 días con un tiempo de exposición de 1 s. Al aumentar el tiempo de exposición a 2 s, la muestra necesitaría aproximadamente una semana para obtener la imagen. Sería necesario optimizar el tiempo de exposición y el grosor del corte para equilibrar la carga de trabajo de la máquina.

Recomendamos a los investigadores que realicen experimentos de calibración para generar la relación "sensibilidad versus espesor de corte" antes de los experimentos reales como se describe en el Pseudocódigo 2. La relación revelaría los valores óptimos de espesor de corte como se muestra en la Fig. 10. El experimento de calibración se puede realizar seccionando el tejido de prueba con un grosor de corte pequeño. Luego se aplica una simulación de sección e imagen a los datos para generar la relación entre diferentes valores de espesor de corte y detectabilidad. Los experimentos de calibración garantizan que el grosor del corte se optimice para diferentes experimentos en los que varía el brillo de las células.

Además, informamos las características de detectabilidad de situaciones en las que los supuestos clave no se cumplieron (Figs. 12, 13, 14, 15, 16, 17). Las simulaciones debían estudiar los efectos de (1) la falta de homogeneidad del tejido, (2) las variaciones del brillo de las células y (3) la superposición de la señal celular en la detectabilidad, como se observa en las curvas de sensibilidad-espesor (Figs. 13, 15, 17). Diferentes situaciones dieron como resultado diferentes patrones únicos en las curvas de sensibilidad-espesor, como se explica en la sección Resultados. Creemos que estas características de las curvas se pueden utilizar para evaluar si los supuestos clave se cumplen en cualquier experimento. En todas las simulaciones, las sensibilidades de detección no fueron del 100% incluso si el operador cortó la muestra con el espesor de corte óptimo [según lo determinado por la Ec. (5)]. Los puntos óptimos tienden a retroceder más (hacia valores más pequeños) dependiendo del grado de violación del supuesto clave. Por lo tanto, recomendamos al operador utilizar un grosor de corte más pequeño para minimizar la reducción de la sensibilidad si se espera la infracción. A menudo, los investigadores analizan un órgano a la vez en lugar de analizar una muestra de diferentes tejidos mezclados. Por ejemplo, distribución de células/microesferas en un solo órgano como se presenta en este artículo. En tal caso, el efecto de la variabilidad µT puede ser mínimo porque el valor del parámetro se puede estimar por separado para cada tipo de tejido. Algunos problemas, como la superposición de señales celulares o la distribución irregular, se pueden resolver digitalmente mediante técnicas de procesamiento de imágenes. Nuestro grupo30,34, así como otros7, propusieron algoritmos que pueden separar eficazmente dos (o más) señales fluorescentes subterráneas superpuestas en los datos de crioimagen.

Finalmente, demostramos que la tecnología de crioimagen podría usarse para rastrear células y microesferas fluorescentes en cualquier parte del animal con sensibilidad microscópica. En este estudio, se utilizaron conjuntos de datos de dos experimentos diferentes. Estos incluyeron células marcadas con fluorescencia en un modelo de ratón (Fig. 4) y microesferas fluorescentes en un corazón de cerdo (Fig. 5). Con parámetros de imagen cuidadosamente elegidos, la crioimagen podría producir una tasa de recuperación (número de detecciones/administración) de hasta el 94 %. Creemos que las crioimágenes podrían proporcionar datos de imágenes con tasas de recuperación similares en otras aplicaciones biológicas, como la administración de fármacos, la perfusión sanguínea, la metástasis del cáncer, etc.

En conclusión, presentamos un modelo que describe la relación entre la detección de células fluorescentes y el grosor del corte para un sistema de crioimagen de sección e imagen. El modelo podría usarse para sugerir el valor de espesor de corte óptimo que garantice la detección ideal de células fluorescentes y al mismo tiempo minimice el tiempo de exploración. También validamos con éxito el modelo utilizando datos de microesferas fluorescentes y datos de células madre marcadas con fluorescencia. El modelo también proporciona un factor de corrección para tener en cuenta la sensibilidad degradada con un grosor de corte subóptimo. Recomendamos adquirir un conjunto de datos de calibración de corte fino para cada escaneo que implique la cuantificación absoluta de la distribución espacial del fluoróforo, lo que sirve como garantía de calidad en el caso de que se necesite una corrección. Dado que la tecnología de crioimagen se ha utilizado en muchas aplicaciones biológicas, este trabajo contribuye a aumentar tanto el rendimiento experimental como la garantía de calidad, avanzando así aún más en su usabilidad y confiabilidad.

Los conjuntos de datos y los códigos fuente, que se utilizan/generan/analizan durante el estudio actual, están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Este trabajo fue financiado en parte por las siguientes fuentes: Universidad de Chiang Mai, Tailandia (PW), el Centro Coordinador para Estudiantes con Becas de Ciencia y Tecnología del Gobierno Tailandés o CSTS Tailandia (PW), la Agencia Nacional de Desarrollo de Ciencia y Tecnología o NSTDA Tailandia (PW ), los Institutos Nacionales de Salud NIH R42CA124270 (DLW), NIH T32EB007509 (BLE y DLW), NIH R01EB028635 (DLW), NIH R43GM145205 (MG) y la Tercera Frontera de Ohio: Perfusión cardíaca con tomografía computarizada (BLE y DLW). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH y otras agencias de financiación.

Deseamos agradecer al Prof. Kenneth R. Cooke, MD (el Centro Oncológico Johns Hopkins Kimmel, Baltimore, MD) por proporcionar los datos del modelo de ratón, al Prof. Hiram G. Bezerra, MD Ph.D. (University Hospitals Cleveland Medical Center, Cleveland, OH) por proporcionar los datos del modelo porcino, Wouter Van't Hof, Ph.D. (Cleveland Cord Blood Center, Cleveland, OH) y Athersys Inc. (Cleveland, OH) por proporcionar la línea celular MAPC. También nos gustaría agradecer a Saada Eid, Steve Schomisch y Cassie Cipriano (Case Western Reserve University, Cleveland, OH) por su ayuda con los experimentos con animales.

Instituto de Ingeniería Biomédica, Departamento de Ingeniería Informática, Centro de Excelencia en Tecnología de Infraestructura e Ingeniería de Transporte, Universidad de Chiang Mai, Chiang Mai, 50200, Tailandia

Patiwet Wuttisarnwattana

Imaging Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, 44195, EE. UU.

Brendan Eck

BioInVision Inc., Mayfield Village, OH, 44143, EE. UU.

Madhusudhana Gargesha

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Case Western Reserve, Cleveland, OH, 44106, EE. UU.

Brendan L. Eck y David L. Wilson

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PW fue un contribuyente importante en el desarrollo de conceptos y métodos, procesamiento e interpretación de imágenes, y en la redacción del manuscrito. BLE fue el principal contribuyente que desarrolló los modelos de distribución espacial como se describe en las Ecs. (7)–(10) y (16)–(17). PW, BLE y MG realizaron la adquisición de imágenes, la recopilación y el procesamiento de datos. BLE, MG y DLW realizaron análisis e interpretación de datos y escribieron el manuscrito. DLW proporcionó apoyo financiero para esta investigación. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Patiwet Wuttisarnwattana o David L. Wilson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wuttisarnwattana, P., Eck, BL, Gargesha, M. et al. Espesor de corte óptimo para mejorar la precisión del análisis cuantitativo de la distribución de microesferas y células fluorescentes en crioimágenes. Informe científico 13, 10907 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37927-y

Descargar cita

Recibido: 09 de diciembre de 2022

Aceptado: 29 de junio de 2023

Publicado: 05 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37927-y

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